学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

阻塞性胆汁淤积人肝细胞MRP3和MRP2表达改变及其调控机制的研究

作　者: 吴晓平
导　师: 陈文生
学　校: 第三军医大学
专　业: 内科学
关键词: 胆汁淤积 MRP3 MRP2 SP1 FXR SHP RT-PCR WB 免疫荧光 EMSA
分类号: R575
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 97次
引　用: 1次
阅　读: 论文下载

内容摘要

MRPs(multidrug resistance-assocated proteins)家族,是位于多种极性细胞膜表面介导其底物依赖ATP自细胞内转运至细胞外的一类膜糖蛋白,是具有重要生理功能的有机阴离子转运蛋白,属于具有ATP结合域的盒式跨膜转运子蛋白超家族(ATP binding cassette, ABC-transporter proteins superfamily)[1]。目前已知至少有9种,包括ABCC1-6/MRP1-6和ABCC10-12/MRP7-9,其中MRP1-8是已知的有机阴离子转运器。它们能够转运多种有机阴离子,包括葡萄糖醛酸结合物﹑GSH(还原型谷光苷肽)﹑硫酸盐或某些抗癌药物等[2]。MRP2(cMOAT,小管多特异性有机阴离子转运器)主要位于肝细胞膜的小管面区域,同时也表达在肾脏近曲小管细胞的顶端膜和肠上皮细胞,也可能表达在胎盘滋养细胞顶端膜[3,4]。在正常生理情况下,Mrp2/MRP2在肝脏表达水平高,而BDL大鼠及Dubin-Johnson综合征的病人表达降低。多耐药相关蛋白3(multidrug resistance-associated protein 3,MRP3)是近年新克隆的一种转运蛋白基因,分别与MRP1、MRP2有58%和48%的同源性[5,6],主要分布于肝细胞、胆管上皮、肠黏膜上皮和肾小管上皮细胞临近血管的基底侧膜,能运输有机阴离子(包括胆盐、17β-雌二醇和一些抗癌药物等)进入血液[7]。有关研究表明,在正常肝脏细胞基底侧膜MRP3表达很低或不表达,但在胆道结扎所致的急性胆汁淤积动物模型的肝脏中,MRP3的表达量却非常高[8]。同时发现在人类胆汁淤积性疾病,如: Dubin-Johnson综合征及家族性遗传性黄疸时MRP3表达也是急剧增高的,而肝细胞小管面的MRP2的表达量却明显下降。这种负相关的表达提示了MRP3的高表达可能是对MRP2功能削弱的一种补偿,人们普遍认为MRP3的表达增高是在胆汁淤积状态下肝细胞的一种代偿性自我保护反应[9,10]。最近的研究报道,在体外细胞培养与胆道结扎的动物模型实验中,肝脏MRP3基因mRNA转录表达与核受体CPF、RXRα:RARα、Sp1、PXR等基因相关。其中核受体CPF/Lrh-1能够上调MRP3/Mrp3 mRNA的表达[11]。SP1是MRP3表达的一个转录激活因子,RXRα:RARα异二聚体则能够通过抑制SP1活性来降低MRP3的表达[12]。另外核受体CAR、PXR等也对MRP3的基因表达起一定的调节作用[13,14]。有报道FXR激活后可上调7α羟化酶( cholesterol-7-αhydroxylase, CYP7A1 )基因和MRP2的转录,诱导其在体外培养小鼠肝细胞中表达上调,促进胆红素葡萄糖醛酸酯的排出,以及通过阻遏胆固醇的编码,反馈性地抑制胆汁酸的合成[15,16],但是具体机制尚不清楚。目前的研究主要集中在体外细胞培养和动物模型实验,而直接针对以“人”为对象的研究鲜有报道。本实验通过收集40例人体肝组织标本,对阻塞性胆汁淤积时MRP3、MRP2进行研究,从而进一步探讨与研究阻塞性胆汁淤积时人肝细胞膜转运蛋白MRP3、MRP2的表达和MRP3的转录调控机制。方法收集40例肝组织标本分组(对照组:正常肝组织;淤胆组:淤胆肝组织)后,分别在mRNA水平(RT-PCR)与蛋白水平(Western blot)检测分析膜转运蛋白MRP3、MRP2表达改变,对MRP2与核受体FXR、SHP表达的关系,以及MRP3调节相关核受体基因SP1表达变化进行研究;应用免疫荧光检测膜转运蛋白MRP3、MRP2与核受体SP1在正常与淤胆肝组织的表达以及定位情况;通过EMSA来检测MRP3基因启动子区反应元件与核受体SP1结合活性改变。结果1.通过RT-PCR实验对膜转运蛋白基因MRP2、MRP3及SP1在mRNA水平表达进行分析,结果表明:在阻塞性胆汁淤积时,人肝脏组织MRP2基因mRNA表达无明显变化,而MRP3基因mRNA表达均显著增高,增高约3倍左右,SP1基因mRNA表达增高约2倍。2.免疫荧光检测结果表明,人肝脏阻塞性胆汁淤积时,肝细胞膜小管面转运蛋白MRP2显著减少,而基底侧膜的MRP3表达明显增加,核受体SP1的表达也显著增加。3.人肝脏阻塞性胆汁淤积时,通过Western blot实验对膜转运蛋白MRP3与核受体SP1,MRP2与核受体FXR、SHP在蛋白水平表达进行分析,结果表明:人肝细胞膜转运蛋白MRP3表达增高约4倍;细胞总蛋白中MRP2表达未见明显变化,而细胞膜蛋白中MRP2水平明显降低约4倍;FXR与SHP均降低约2～2.5倍,SP1表达增高约3倍。4.人肝脏阻塞性胆汁淤积时,通过EMSA检测结果表明:MRP3基因启动子区反应元件与核受体SP1结合活性显著增加约4倍。讨论MRP3(ABCC3)在正常肝细胞基底侧膜低表达或不表达。而当胆汁淤积发生时,肝细胞MRP3表达却显著增高。同时,又由于MRP3转运底物与MRP2有着广泛的同源性,所以人们普遍认为MRP3的高表达是对MRP2功能削弱的一种代偿,可以加快胆汁酸从肝细胞泵入血液,再经肾脏排除体外,以减轻胆汁淤积时肝细胞受胆酸毒性损伤的程度,具有保护肝脏的作用。本实验通过对人体肝组织标本研究发现,MRP2在肝细胞膜定位表达减少,肝细胞膜蛋白中MRP2的表达也显著降低,而MRP3在肝细胞膜的表达量急剧增高。这与先前相关文献报道的体外细胞培养以及胆道结扎的胆汁淤积动物模型实验结果相一致[8,9,10]。但在mRNA水平,MRP3明显升高,MRP2却无明显变化,此结果提示MRP2的表达可能存在转录后调控机制;MRP2总蛋白水平没有明显变化,可能由于MRP2蛋白的定位表达能力障碍所致,其发生机制尚不清楚,尚待进一步研究。在胆汁淤积状态下,位于肝细胞小管面膜上的排出泵MRP2的表达明显减少,使胆汁酸、内源性和外源性的化合物等有毒物质不能排泌到胆管中,而此时位于血管面的排除泵MRP3的表达增高,可能是对MRP2功能减弱的补偿,使肝细胞内的毒性物质被泵出到血液,再通过肾脏排出体外,从而减轻肝脏的损伤。目前对于MRP2和MRP3在胆汁淤积中表达变化的调控机制尚不完全清楚,以往在体外细胞培养和动物胆汁淤积模型研究发现,胆汁酸作为配体可以通过FXR/SHP上调Mrp2[16,17,18]表达,从而降低胆汁酸对肝脏的损害。很少有关于人类肝脏研究的数据证实以前的研究结果,因为人类和啮齿动物之间可能存在显著差异。在人阻塞性胆汁淤积肝脏中,我们发现MRP2表达下降可能与核受体FXR、SHP降低有关,这与以往的有关研究一致。在人阻塞性胆汁淤积中核受体SP1 mRNA和蛋白水平都同量增加,EMSA实验结果表明MRP3基因启动子区反应元件与SP1结合活性显著增高,SP1与MRP3基因启动子区反应原件有两个结合位点(GGGCGG)。分别位于MRP3基因5’末端区域-103～-97nts,-108～-114nts。我们的结果首次证实人阻塞性胆汁淤积性肝病中核受体SP1可能参与上调MRP3基因mRNA的转录表达。结论通过本实验研究结果发现,在人阻塞性胆汁淤积时肝细胞膜蛋白MRP2的下降可能与核受体FXR、SHP表达的减少有关,MRP2基因可能存在转录后表达调控的机制;核受体SP1对MRP3基因转录表达可能具有上调的功能。

全文目录

英文缩写一览表  4-6
英文摘要  6-10
中文摘要  10-13
论文正文阻塞性胆汁淤积人肝细胞MRP3 和MRP2 表达改变及其调控机制的研究  13-51
  前言  13-15
  第一部分阻塞性胆汁淤积核受体FXR、SHP 与人肝细胞膜转运蛋白MRP2表达变化的研究  15-33
    材料与方法  15-26
    结果  26-31
    讨论  31-33
  第二部分阻塞性胆汁淤积核受体SP1 对人肝细胞膜转运蛋白MRP3转录表达的调控机制研究  33-46
    材料与方法  33-37
    结果  37-44
    讨论  44-46
  全文结论  46-47
  致谢  47-48
  参考文献  48-51
文献综述多耐药相关蛋白MRP2 与MRP3 在阻塞性胆汁淤积作用机制的研究进展  51-59
  参考文献  55-59
硕士研究生期间主要发表论文  59

阻塞性胆汁淤积人肝细胞MRP3和MRP2表达改变及其调控机制的研究

内容摘要

全文目录

相似论文