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用杂交瘤技术建立永生化肝细胞研究药物代谢

作　者: 顾若兰
导　师: 窦桂芳
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 药理学
关键词: 原代肝细胞 杂交瘤技术 肝杂交瘤细胞 细胞色素P450酶 体外药物代谢研究
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


用杂交瘤技术建立永生化肝细胞研究药物代谢研究背景：原代肝细胞由于包含几乎肝脏所有的药物代谢酶及相应辅助因子，代谢功能与体内肝细胞相似，一直是体外药物代谢研究推崇的经典模型。但原代肝细胞体外分离培养条件复杂、药物代谢酶活性维持时间短、不能传代培养长期使用等弊端，导致原代肝细胞的应用成本较高、缺乏灵活性。因此，药物代谢研究领域迫切需要建立原代肝细胞的理想替代模型。研究目的：选择适宜种属和组织起源的肿瘤细胞株，采用杂交瘤技术将其与原代肝细胞融合，建立既具有原代肝细胞正常药物代谢活性，又具有肿瘤细胞无限增殖能力，可体外长期培养传代利用的永生化肝细胞(肝杂交瘤细胞株)。研究内容：分离、培养、冻存具备良好药物代谢活性的大鼠原代肝细胞；诱变筛选不同种属及组织起源的HGPRT基因缺陷(HGPRT~-)型肿瘤细胞株作为亲本瘤细胞的考察；利用杂交瘤技术将原代肝细胞与不同亲本瘤细胞株融合，建立符合药物代谢研究要求、具备良好药物代谢酶活性的肝杂交瘤细胞株，并对其生物学特性及功能进行鉴定；评价肝杂交瘤细胞株在体外药物代谢研究中的应用价值。技术方法：改进胶原酶二步灌流法分离培养大鼠原代肝细胞；化学诱变剂诱变、细胞克隆化培养、HAT筛选鉴定HGPRT~-型肿瘤细胞株；PEG化学融合法进行细胞融合实验；相关的细胞功能检测和鉴定综合采用形态学观察、HAT筛选、染色体核型分析、双荧光标记共聚焦激光扫描检测以及特征性生化指标包括糖原合成、白蛋白分泌和尿素合成功能的测定；细胞的药物代谢活性评价采用底物孵育法，HPLC和LC-MS技术检测。结果：优化建立了大鼠原代肝细胞的分离培养方法，所得原代肝细胞保持分泌白蛋白、合成尿素和糖原等肝细胞特征生物合成功能，具备全面良好的450酶代谢活性；克隆筛选了HAT敏感的HGPRT~-型人SMMC-7721肝癌细胞、小鼠骨髓瘤SP2／0细胞和大鼠H4TG肝癌细胞3株不同种属和组织起源的肿瘤细胞作为亲本瘤细胞进行与原代肝细胞的融合实验考察，得到的3株不同融合细胞表现出不同的培养特性。肝-7721杂交瘤细胞和肝-H4TG杂交瘤细胞能长期传代培养且具备药物代谢活性。其中肝-H4TG杂交瘤细胞株在长期培养传代过程中表现出较好的形态学和生物合成功能稳定性，目前已在体外培养5月余，纯化传代25次。具备几种典型P450亚型酶活性，纯化传代5次的肝杂交瘤细胞各典型P450酶活性约为原代肝细胞的40-50％，纯化传代10次后CYP2C、CYP3A活性有所下降，但CYP1A、CYP2D活性无明显改变。结论：3种不同种属和组织起源的亲本瘤细胞与大鼠原代肝细胞融合的结果倾向于表明：原代肝细胞与同组织起源的肝癌细胞融合比与异组织起源的肿瘤细胞融合效率高；原代肝细胞与同种属的肿瘤细胞融合比与异种属肿瘤细胞融合稳定。即应选择同种属起源的肝癌细胞株与原代肝细胞融合建立肝杂交瘤细胞。目前结果表明，大鼠肝-H4TG杂交瘤细胞株至少在较长的一段培养时期内能保持较好的药物代谢活性，在一定程度上可作为原代肝细胞的替代模型应用于药物代谢研究领域。但对其代谢活性的长期稳定维持，可能尚有未知影响因素与机制的参与和作用，值得做进一步深入探讨。

全文目录


英文缩略语表  6-7
中文摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
引言  11-14
第一章 原代肝细胞的分离培养和冻存  14-35
  1. 实验试剂和仪器  14-18
  2. 原代肝细胞分离方法的建立优化  18-19
  3. 原代肝细胞培养条件  19
  4. 原代肝细胞冻存复苏条件的探讨  19-20
  5. 原代肝细胞P450酶活性检测  20-24
  6. 原代肝细胞生物学功能检测  24
  7. 实验结果  24-32
  8. 讨论与小结  32-35
第二章 HGPRT基因缺陷型亲本瘤细胞的诱变筛选  35-42
  1. 实验试剂和仪器  35-36
  2. 实验原理  36-37
  3. 诱变筛选方法  37-39
  4. 实验结果  39-40
  5. 讨论与小结  40-42
第三章 原代肝细胞与HGPRT~-型亲本瘤细胞的融合鉴定及生物学特性评价  42-56
  1. 实验试剂和仪器  42-44
  2. 实验原理  44-45
  3. 原代肝细胞与HGPRT~-型亲本瘤细胞的融合培养  45-47
  4. 肝杂交瘤细胞的鉴定和特性检测  47-48
  5. 实验结果  48-54
  6. 讨论与小结  54-56
第四章 肝杂交瘤细胞株的药物代谢活性评价  56-68
  1. 实验试剂和仪器  56-58
  2. 实验设计  58-61
  3. 实验结果  61-66
  4. 讨论与小结  66-68
结论  68-70
参考文献  70-74
致谢  74-75
个人简历  75
硕士期间已发表的文章  75-76
附发表论文  76-86

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药理学
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