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酵母双杂交技术筛选与CUEDC2相互作用的蛋白质及其功能研究

作　者: 刘卉
导　师: 张学敏
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 细胞生物学
关键词: CUEDC2 GADD34 p53 酵母双杂交 相互作用 转录活性
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
下　载: 127次
引　用: 1次
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内容摘要


CUEDC2(CUE domain containing 2)，是一个包含CUE结构域的蛋白质，其生物学功能目前还不清楚。CUE结构域由约40个氨基酸组成，能与泛素结合，广泛存在于多种真核蛋白质中。CUE结构域与单泛素、多泛素均存在相互作用，且发挥不同功能。泛素化是调节蛋白质功能的一种重要形式，是细胞信号转导的重要调控机制。为了揭示CUEDC2的生物学功能，我们应用酵母双杂交筛选技术对CUEDC2相互作用蛋白质进行了筛选并对其功能进行了初步研究。我们以CUEDC2基因全长作为诱饵，从人乳腺cDNA文库中筛选与其相互作用的蛋白质。我们从185个候选克隆中筛选出7个阳性克隆与CUEDC2存在相互作用。测序结果表明，这7个克隆分别为四种基因来源：Homo sapiens THAP domain containing，apoptosis associated protein 3(THAP3)；Homo sapiens suppressor of cytokine signaling 3(SOCS3)；Homo sapiens apoptosis associated protein，growth arrest and DNA damage-inducible gene 34(GADD34)；Homo sapiens IkB kinase-beta(IKKβ)。我们从人乳腺文库中钓取了这四种蛋白质的cDNA序列，为下一步的结构和功能研究做好准备。CUEDC2与四种蛋白质之间的相互作用随后通过体外的GST pull-down实验和体内的免疫共沉淀实验得到了验证。为进一步阐明CUEDC2的生物学功能，我们以酵母筛选结果为依据研究CUEDC2和GADD34相互作用的生物学意义。根据文献报道，GADD34能够促进p53转录激活活性，我们首先利用双荧光报告系统在真核细胞MCF-7中验证了GADD34对p53转录活性的促进作用。我们将CUEDC2单独转入MCF-7细胞，检测p53转录活性，结果发现，CUEDC2对p53活性无影响，但是CUEDC2与GADD34共转时，可以明显增强GADD34对p53活性的促进作用。我们发现CUEDC2在哺乳动物细胞中能够特异的增加GADD34蛋白质表达水平。提示CUEDC2可能通过与GADD34相互作用，促进GADD34蛋白质表达，从而影响GADD34对p53转录活性的促进能力。总之，我们的实验表明，CUEDC2能够通过结合GADD34，并影响GADD34蛋白质表达水平，进而影响p53的活性。因此，本文所发现的CUEDC2和GADD34相互作用复合体可能为我们研究CUEDC2的生物学功能提供启示，进一步研究有可能发现CUEDC2参与调节信号转导的机制。

全文目录


摘要  7-9
Abstract  9-11
引言  11-13
第一部分 酵母双杂交技术筛选与CUEDC2相互作用的蛋白质  13-27
  材料与方法  13-20
    1.材料及来源  13-14
      1.1 菌株和质粒  13
      1.2 主要试剂  13-14
    2.实验方法  14-20
      2.1 pGBKT7-CUEDC2诱饵载体构建  14-17
      2.2 文库扩增  17
      2.3 酵母细胞的转化  17
      2.4 Western blot分析  17-18
      2.5 从酵母中提取质粒  18-20
  结果  20-26
    1.诱饵表达载体的构建和鉴定  20
    2.诱饵蛋白在酵母细胞中的表达鉴定  20-21
    3.诱饵蛋白在酵母细胞中自身转录激活活性的测定  21
    4.人乳腺文库的扩增  21-22
    5.初步筛选结果  22-23
    6.重复鉴定结果  23-24
    7.筛选到的基因cDNA序列的钓取及克隆  24-26
  小结  26-27
第二部分 CUEDC2与四种蛋白质相互作用的验证  27-46
  材料与方法  27-33
    1.材料、试剂及仪器  27-28
      1.1 质粒、菌株、细胞株  27
      1.2 主要试剂  27
      1.3 细胞培养试剂  27
      1.4 抗体  27-28
      1.5 大型仪器  28
    2.实验方法  28-33
      2.1 真核表达载体的构建  28-29
      2.2 GST融合表达载体的构建  29-30
      2.3 293T细胞瞬时转染  30
      2.4 GST融合蛋白在大肠杆菌中的表达纯化  30-31
      2.5 GST沉淀(GST pull-down)分析  31
      2.6 免疫共沉淀(Co-IP)  31-33
  结果  33-45
    1.真核表达载体的构建及鉴定  33-36
    2.GST表达载体的构建与鉴定  36-37
    3.GST-CUEDC2融合蛋白质的诱导表达与纯化  37-39
    4.CUEDC2与酵母筛选所得四种蛋白质相互作用的验证  39-45
      4.1 CUEDC2与THAP3相互作用验证  39-40
      4.2 CUEDC2与SOCS3相互作用验证  40-41
      4.3 CUEDC2与GADD34相互作用验证  41-43
      4.4 CUEDC2与IKKβ相互作用验证  43-45
  小结  45-46
第三部分 CUEDC2与GADD34复合物的初步功能研究  46-54
  材料与方法  46-49
    1.材料  46-47
      1.1 细胞株、质粒  46
      1.2 试剂及仪器  46-47
    2.实验方法  47-49
      2.1 细胞转染  47
      2.2 荧光素酶活性测定方法  47-48
      2.3 Western blot分析蛋白质表达水平  48
      2.4 p53的转录活性的测定  48-49
  结果  49-53
    1.GADD34对p53转录活性的影响  49
    2.CUEDC2对p53转录活性的影响  49-50
    3.CUEDC2与GADD34复合体对p53转录活性的影响  50-51
    4.CUEDC2对GADD34蛋白质表达的影响  51-53
  小结  53-54
讨论  54-55
总结  55-56
参考文献  56-58
致谢  58-59
附录  59-61
文章发表与交流  61-62
附：应用酵母双杂交筛选与CUEDC2相互作用的蛋白质  62-69

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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