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卵子突变基因在小鼠早期胚胎发育过程中作用机理研究

作　者: 宋根娣
导　师: 郑振宇
学　校: 河南农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: DDK小鼠卵子突变基因候选基因 RT-PCR
分类号: S865.13
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

为了研究携带卵子突变基因(ovum mutant或Om)的DDK雌鼠与其它近交系雄鼠交配时表现出极性不育现象,本试验以杂合致死胚胎(DDK♀x BALB/C♂)为主要研究对象,纯合正常胚胎(DDK♀x DDK♂)为对照组进行了研究。通过对正常交配后植入前期受精卵的采集、观察,发现了杂合胚胎从8细胞期之后开始发生凋亡现象；进一步利用半定量RT-PCR技术,比较候选基因在不同交配组合植入前期受精卵中表达情况,从分子水平上探索Om基因的作用机制。本研究由两部分组成：试验一不同交配组合小鼠植入前期受精卵的采集及观察1、试验用交配组合的建立Om基因导致小鼠胚胎致死现象的产生在于交配组合的严格性,(DDK♀x BALB/c♂)在Om基因作用下出现胚胎致死现象,而DDK品系本交交配得到F1小鼠胚胎能够正常发育,未出现任何发育的异常情况。因此,选择纯合作为对照组,其植入前期受精卵的发育情况及候选基因表达情况可作为正常胚胎的对照标准。2、植入前各时期受精卵的采集及观察选取60日龄小鼠,按照超排处理与正常对照将雌鼠分成两组,并分别按照雌雄比例1：1方式合笼交配。根据胚胎发育时间,镜检观察、采集不同时期受精卵。结果表明,超排处理DDK雌鼠产生的胚胎,大量处于2细胞期发育停滞。正常交配方式中杂合胚胎在8细胞期后发生凋亡现象,并确定为死亡细胞。采集形态学上发育正常的2细胞至8细胞期发育阶段胚胎各70-110枚。试验二利用半定量RT-PCR检测候选基因在不同交配组合小鼠植入前期受精卵中的表达1、候选基因的选择目前在小鼠早期胚胎发育过程中,主要表达的功能基因有原癌基因、生长因子、生长发育及凋亡基因、白细胞抑制因子等几大类,其中各个功能基因表达量变化引起不同的影响。因此,试验选取8个功能基因作为候选基因,其差异表达能够导致胚胎的非正常发育,并且与Om基因引发的胚胎致死现象在胚胎学及生理学上极为相似。所以,杂合胚胎与纯合胚胎在发育过程中候选基因片段的表达差异,可认为是直接导致胚胎死亡的因素。2、半定量RT-PCR检测通过半定量PCR检测比较8个候选基因在杂合胚胎与纯合胚胎2细胞期、4细胞期、8细胞期受精卵中mRNA的相对含量。结果表明,在两种交配组合中,候选基因的中部分基因表达量发生差异,H-ras, TGF-α, C-myc基因在4细胞期,8细胞期两种交配组合中表达量相同,而EGF-R,Bcl-2基因在4细胞,8细胞期检测到表达量差异显著；Mcl-1,EGF在三个时期内表达量差异显著,并且差异表达的候选基因在杂合组合中表达量明显高于纯合组合。因此,纯合组合中胚胎细胞早期发育后期出现的致死现象,可能是由于这些差异表达基因的作用直接或间接导致的。本试验通过对携带Om基因的DDK小鼠杂合胚胎植入前受精卵发育过程的观察及一系列在着床前期影响胚胎正常发育的功能基因表达量差异的研究,分析Om基因引发的胚胎致死过程,揭示了Om基因是通过一类影响胚胎发育的功能基因而间接导致小鼠胚胎致死现象。为进一步阐明卵子突变基因的作用机理,完善小鼠胚泡形成过程中分子调控的相关理论奠定了一定的基础。

全文目录

致谢  4-8
摘要  8-10
1.文献综述  10-26
  1.1 小鼠早期胚胎发育中基因表达的过程  10-17
    1.1.1 母源型mRNA的表达过程  10-11
    1.1.2 母型调控向合子型调控过渡的机制  11-13
    1.1.3 胚胎合子基因组的启动  13-14
    1.1.4 哺乳动物早期胚胎的发育阻滞  14-17
  1.2 哺乳动物早期胚胎发育过程中的细胞凋亡的生物学意义  17
  1.3 卵子突变基因研究的历史与现状  17-19
    1.3.1 Om基因的发现  17-18
    1.3.2 Om基因的相关研究  18-19
  1.4 影响早期胚胎凋亡的因素  19-20
    1.4.1 体内发育胚胎的凋亡情况  19
    1.4.2 超数排卵对胚胎质量的影响  19
    1.4.3 体外发育环境对胚胎的影响  19-20
  1.5 早期胚胎细胞凋亡相关基因及其表达调控  20-24
    1.5.1 原癌基因  20-22
      1.5.1.1 C-myc  20-21
      1.5.1.2 Ras  21-22
    1.5.2 生长因子  22
      1.5.2.1 表皮生长因子(EGF)  22
      1.5.2.2 转化生长因子(TGF-α)  22
    1.5.3 凋亡基因  22-24
      1.5.3.1 Bcl-2  23
      1.5.3.2 Mcl-1基因  23-24
    1.5.4 白血病抑制因子(LIF)  24
  1.6 半定量RT-PCR技术  24-25
  1.7 研究的目的和意义  25-26
2.引言  26-27
3.试验一不同交配组合小鼠植入前期受精卵的采集及观察  27-31
  3.1 试验材料  27-28
    3.1.1 试验小鼠  27
    3.1.2 试验所用主要仪器、设备  27
    3.1.3 试验所用主要试剂  27
    3.1.4 常用试剂配制  27-28
  3.2 试验方法  28-29
    3.2.1 小鼠的超排处理  28
    3.2.2 早期胚胎的采集  28-29
  3.3 结果与分析  29-31
    3.3.1 不同PMSG与hCG剂量组合对DDK雌鼠超排效果的影响  29
    3.3.2 不同交配组合早期胚胎的形态学观察与采集  29-31
  3.4 小结  31
4.试验二不同交配组合中候选基因的差异表达检测  31-45
  4.1 试验材料  32-34
    4.1.1 试验样本  32
    4.1.2 试验所用主要仪器、设备  32
    4.1.3 试验所用主要试剂及试剂盒  32-33
    4.1.4 常用试剂配制  33-34
  4.2 试验方法  34-40
    4.2.1 样本的采集和处理  34
    4.2.2 胚胎细胞总RNA的提取、纯化  34
    4.2.3 总RNA质量检测方法  34-35
    4.2.4 RT-PCR操作方法  35-40
      4.2.4.1 扩增片段回收、克隆及测序  37-40
    4.2.5 半定量分析候选基因的表达情况  40
    4.2.6 统计分析  40
  4.3 结果与分析  40-45
    4.3.1 总RNA提取、纯化与检测结果  40-41
    4.3.2 候选基因的RT-PCR扩增结果  41-43
      4.3.2.1 β-actin检测结果  41
      4.3.2.2 2细胞期候选基因的RT-PCR扩增电泳结果  41-42
      4.3.2.3 4细胞期候选基因的RT-PCR扩增电泳结果  42
      4.3.2.4 8细胞期候选基因的RT-PCR扩增电泳结果  42-43
    4.3.3 扩增片段测序结果  43
    4.3.4 候选基因的半定量分析  43-45
  4.4 小结  45
5.结论与讨论  45-51
  5.1 Om基因在DDK小鼠早期胚胎发育中的影响  45-46
  5.2 超排处理对胚胎细胞发育的影响  46-47
  5.3 胚胎细胞中RNA的提取  47-48
  5.4 半定量检测技术  48
  5.5 候选基因在在不同交配组合小鼠早期胚胎细胞中的表达  48-51
参考文献  51-58
Abstract  58-60
附录  60-63

卵子突变基因在小鼠早期胚胎发育过程中作用机理研究

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