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酶法生产β-丙氨酸的研究

作　者: 洪敏
导　师: 裘娟萍
学　校: 浙江工业大学
专　业: 微生物学
关键词: 工程菌株 发酵 PanD 纯化 细胞固定化 β-丙氨酸
分类号: TQ922.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 63次
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内容摘要


本论文采用PCR扩增基因技术,将工程菌株E. coli BL21 (DE3)/ pET28b(+)-panD的panD基因克隆后连接至pET28c(+)载体上,构建重组质粒pET28c(+)-panD,转化表达宿主菌E. coli BL21(DE3),经卡纳霉素抗性筛选获得了高效表达L-天冬氨酸α-脱羧酶的工程菌株E. coli BL21(DE3)/ pET28c(+)-panD,酶活力为92.52 U/L。将新构建的菌株与原菌株E. coli BL21 (DE3)/ pET28b(+)-panD进行SDS-PAGE分析比较,发现新构建的菌株能正确表达PanD,但同样PanD酶自剪切率低,大部分是未剪切的π’-亚基。以乳糖为诱导剂,对新构建的工程菌株E. coli BL21(DE3)/ pET28c(+)-panD进行培养条件的优化,得到最适培养条件:乳糖诱导时间20 h,乳糖浓度12 g/L,诱导温度为35℃,诱导菌龄为3.5 h,诱导培养基初始pH 5.5。优化后酶活力为186 U/L,与未优化前相比,酶活力提高101%。对新构建的工程菌株E. coli BL21(DE3)/ pET28c(+)-panD超声波破壁后的粗酶液经过硫酸铵分级盐析和Ni-亲和层析两步纯化,PanD酶纯度在95%以上,比活力达到了20.15 U/mg,纯化倍数为6.58,回收率为68.34%。通过对纯酶进行酶学性质的研究,得到最适反应温度为45℃,最适pH为8.0,金属离子对酶活力其几乎无影响。PanD较稳定,高温可提高PanD酶的自剪切效率。以海藻酸钠包埋材料对菌株E. coli BL21 (DE3)/pET28b(+)-panD进行细胞固定化,优化后的条件为:以CaCl2为成型剂,海藻酸钠的浓度为3%,菌体包埋量为10%,以天冬氨酸钾为底物转化24 h,底物摩尔转化率达6.48%。固定化颗粒连续转化至第五个批次时才出现明显的溶解现象。

全文目录


摘要  5-7
ABSTRACT  7-14
第一章 综述  14-29
  1.1 β-丙氨酸简介  14
  1.2 丙酮酰基依赖型氨基酸脱羧酶  14-19
    1.2.1 L‐组氨酸脱羧酶  15-17
      1.2.1.1 Prv-HisDCase 结构  16
      1.2.1.2 Prv-HisDCase 酶学性质的研究  16-17
    1.2.2 精氨酸脱羧酶  17-18
      1.2.2.1 Prv-ArgDC 结构  17
      1.2.2.2 Prv-ArgDC 酶学性质的研究  17-18
    1.2.3 L-天冬氨酸α-脱羧酶  18-19
      1.2.3.1 PanD结构  18-19
      1.2.3.2 PanD酶学性质的研究  19
  1.3 细胞固定化  19-25
    1.3.1 固定化材料应具备的条件  20
    1.3.2 常见固定化方法  20-24
      1.3.2.1 吸附法  20
      1.3.2.2 包埋法  20-22
      1.3.2.3 共价结合法  22
      1.3.2.4 交联法  22
      1.3.2.5 复合载体固定化  22-23
      1.3.2.6 无载体固定化  23-24
    1.3.3 固定化对微生物生理变化的影响  24-25
      1.3.3.1 固定化对微生物生长速率的影响  24
      1.3.3.2 固定化对微生物活性的影响  24
      1.3.3.3 固定化细胞对有毒抑制物质的耐受性  24-25
  1.4 选题背景和目的  25-26
  参考文献  26-29
第二章 E. coli BL21 (DE3)/pET28c(+)-panD 工程菌株构建  29-47
  2.1 前言  29
  2.2 材料与方法  29-32
    2.2.1 菌种与质粒  29-30
    2.2.2 仪器与 DNA 分析软件  30
    2.2.3 主要药品与试剂  30-31
      2.2.3.1 菌株构建相关药品试剂  30-31
      2.2.3.2 试剂  31
    2.2.4 培养基  31
      2.2.4.1 活化培养基  31
      2.2.4.2 液体培养基  31
    2.2.5 引物  31-32
  2.3 实验方法  32-40
    2.3.1 E. coli BL21(DE3)/pET28 c(+)-panD 菌株构建  32-33
      2.3.1.1 菌株构建实验流程  32-33
    2.3.2 pET28c(+)质粒的克隆  33-34
      2.3.2.1 E. coli DH5α感受态细胞的制备  33
      2.3.2.2 pET28c(+)质粒转化  33-34
    2.3.3 SDS 碱裂解法制备质粒pET28c(+)（中量制备）  34-35
      2.3.3.1 SDS 碱裂解法制备质粒DNA  34
      2.3.3.2 聚乙二醇沉淀法纯化质粒pET28c(+)  34-35
    2.3.4 SDS 碱裂解法制备质粒pET28b-panD（小量制备）  35
    2.3.5 琼脂糖凝胶电泳  35
    2.3.6 用PCR 技术扩增panD 基因  35-36
      2.3.6.1 PCR 扩增体系  35-36
      2.3.6.2 PCR 扩增条件  36
      2.3.6.3 PCR 扩增产物的纯化  36
    2.3.7 PCR 产物和pET28c(+)质粒的双酶切  36-37
      2.3.7.1 酶切体系  36-37
      2.3.7.2 切胶回收  37
    2.3.8 连接与转化  37-38
      2.3.8.1 连接体系  37-38
      2.3.8.2 E. coli DH5α感受态细胞的制备及转化  38
    2.3.9 质粒pET28 c(+)-panD 鉴定  38-39
      2.3.9.1 PCR 鉴定  38-39
      2.3.9.2 碱基序列测定  39
    2.3.10 E. coli BL21(DE3)/ pET28 c(+)-panD 菌株构建及酶活力鉴定  39-40
      2.3.10.1 E. coli BL21(DE3)/ pET28 c(+)-panD 菌株构建  39
      2.3.10.2 酶活力测定  39-40
      2.3.10.3 重组菌株的 SDS-PAGE 检测  40
  2.4 实验结果  40-46
    2.4.1 重组表达质粒pET28c(+)-panD 构建  40-41
    2.4.2 重组质粒pET28 c(+)-panD 鉴定  41-43
      2.4.2.1 PCR 鉴定  41-42
      2.4.2.2 碱基序列测定  42-43
    2.4.3 重组菌株 E. coli BL21(DE3)/ pET28 c(+)-panD 酶活力检测  43-44
    2.4.4 重组菌株的SDS-PAGE 检测  44-46
  2.5 实验小结  46
  参考文献  46-47
第三章 菌株培养条件的初步研究  47-56
  3.1 前言  47
  3.2 材料与方法  47-48
    3.2.1 菌株  47
    3.2.2 主要仪器设备  47-48
    3.2.3 主要药品与试剂  48
    3.2.4 培养基  48
  3.3 试验方法  48-50
    3.3.1 菌种斜面活化  48
    3.3.2 菌种接种子培养基  48-49
    3.3.3 摇瓶发酵条件的优化  49-50
      3.3.3.1 诱导时间对重组菌株产酶活力的影响  49
      3.3.3.2 不同乳糖浓度对重组菌株产酶活力的影响  49
      3.3.3.3 诱导温度对重组菌株产酶活力的影响  49
      3.3.3.4 不同菌龄对重组菌株产酶活力的影响  49-50
      3.3.3.5 诱导初始pH 值对重组菌株产酶活力的影响  50
    3.3.4 酶活定义  50
  3.4 结果与讨论  50-55
    3.4.1 诱导时间对重组菌株产酶活力的影响  50-51
    3.4.2 不同乳糖浓度对重组菌株产酶活力的影响  51-52
    3.4.3 诱导温度对重组菌株产酶活力的影响  52-53
    3.4.4 不同菌龄对重组菌株产酶活力的影响  53-54
    3.4.5 诱导初始pH 值对重组菌株产酶活力的影响  54-55
  3.5 实验小结  55
  参考文献  55-56
第四章 PanD 的分离纯化及酶学性质研究  56-76
  4.1 前言  56
  4.2 材料与方法  56-58
    4.2.1 菌株  56
    4.2.2 主要仪器设备  56-57
    4.2.3 主要药品与试剂  57-58
      4.2.3.1 主要药品  57
      4.2.3.2 试剂  57-58
    4.2.4 培养基  58
      4.2.4.1 活化培养基  58
      4.2.4.2 种子培养基  58
      4.2.4.3 发酵培养基  58
    4.2.5 PanD 酶活力测定  58
  4.3 实验方法  58-63
    4.3.1 菌株培养  59
      4.3.1.1 菌种斜面活化  59
      4.3.1.2 菌种接种子培养基  59
      4.3.1.3 摇瓶发酵  59
    4.3.2 PanD的纯化  59-61
      4.3.2.1 菌悬液的制备  59
      4.3.2.2 超声波破碎条件的选择  59-60
      4.3.2.3 PanD的硫酸铵盐析  60-61
      4.3.2.4 脱盐  61
      4.3.2.5 Ni-亲和层析纯化  61
      4.3.2.6 脱盐  61
    4.3.3 PanD 酶学性质的研究  61-63
      4.3.3.1 酶的最适反应温度的选择  61-62
      4.3.3.2 酶的最适反应pH的选择  62
      4.3.3.3 酶的热稳定性  62
      4.3.3.4 酶的pH 耐受性  62
      4.3.3.5 金属离子对酶活力的影响  62-63
    4.3.4 温度对PanD自剪切的影响  63
    4.3.5 SDS-PAGE检测PanD  63
  4.4 结果与讨论  63-74
    4.4.1 超声波破壁条件的研究  63-65
    4.4.2 硫酸铵饱和度的选择  65-66
    4.4.3 PanD的分离纯化  66-68
      4.4.3.1 硫酸铵分步盐析  66
      4.4.3.2 脱盐  66
      4.4.3.3 Ni-亲和层析  66-67
      4.4.3.4 PanD纯化  67-68
    4.4.4 PanD 学性质的研究  68-72
      4.4.4.1 酶的最适反应温度的选择  68-69
      4.4.4.2 酶的最适反应pH 的选择  69-70
      4.4.4.3 酶的热稳定性  70
      4.4.4.4 酶的pH 耐受性  70-71
      4.4.4.5 金属离子对酶活力的影响  71-72
    4.4.5 温度对PanD自剪切的影响  72-74
  4.5 实验小结  74-75
  参考文献  75-76
第五章 E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-panD细胞固定化条件的研究  76-92
  5.1 前言  76
  5.2 材料与方法  76-78
    5.2.1 菌株  76-77
    5.2.2 主要仪器设备  77
    5.2.3 主要药品与试剂  77
    5.2.4 培养基  77-78
      5.2.4.1 活化培养基  77
      5.2.4.2 种子培养基  77
      5.2.4.3 发酵培养基  77-78
  5.3 实验方法  78-82
    5.3.1 菌株培养  78
      5.3.1.1 菌种斜面活化  78
      5.3.1.2 菌种接种子培养基  78
      5.3.1.3 摇瓶发酵  78
      5.3.1.4 菌体制备  78
    5.3.2 固定化细胞性能的评价  78-79
      5.3.2.1 固定化颗粒的机械强度考察  78-79
      5.3.2.2 固定化颗粒包埋效果的考察  79
      5.3.2.3 固定化颗粒粘附程度的考察  79
      5.3.2.4 固定化操作难易程度的考察  79
    5.3.3 细胞固定化  79-81
      5.3.3.1 PVA 包埋法  79-80
      5.3.3.2 海藻酸钠包埋法  80-81
    5.3.4 固定化细胞转化  81
      5.3.4.1 固定化细胞分批转化  81
      5.3.4.2 固定化细胞连续转化  81
    5.3.5 相关公式计算  81-82
  5.4 实验结果  82-89
    5.4.1 PVA 不同包埋法比较  82-83
    5.4.2 海藻酸钠包埋法  83-88
      5.4.2.1 不同成型剂的选择  84-85
      5.4.2.2 海藻酸钠浓度的选择  85-86
      5.4.2.3 菌体包埋量的选择  86-87
      5.4.2.4 不同天冬氨酸盐的选择  87-88
    5.4.3 固定化细胞连续转化  88-89
  5.5 实验小结  89-90
  参考文献  90-92
第六章 总结与展望  92-94
致谢  94-95
附录 1. 高效液相色谱检测β-丙氨酸  95-97
附录2：考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量  97-99
附录 3 SDS-PAGE  99-102
攻读学位期间发表的学术论文目录  102

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 发酵法制氨基酸 > 丙氨酸
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