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转入端粒酶逆转录酶基因对猪脐静脉血管内皮细胞永生化的初步研究

作　者: 马泉荔
导　师: 张彦明
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 端粒酶逆转录酶基因脐静脉血管内皮细胞永生化猪
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

猪瘟病毒(CSFV)可在多种动物的组织细胞中复制,但一般不产生致细胞病变效应(CPE)。CSFV感染猪后可使小血管和毛细血管内皮细胞发生变性和坏死,为了方便研究猪瘟病毒的致病机理并提供理想的细胞模型,我们开展了猪脐静脉血管内皮细胞体外培养方法的研究,但细胞通常在体外培养条件下经过10次内的传代后,就会停止分裂增殖,发生衰老和死亡。有学者在体外培养原代细胞的基础上,诱导其自发性永生化或转染永生化基因(如SV40大T抗原和HPV18 E6/E7等DNA肿瘤病毒),建立了永生化细胞系。但肿瘤病毒诱导的永生化细胞系,有许多局限性:外源性基因的整合是随机的,其表达产物可干扰细胞内生理途径而发生非预期的改变,转染获得的是转化细胞而非正常细胞,其表型、核型等可发生改变等。为了克服这种细胞系的缺点,本研究将人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)基因转染至猪脐静脉血管内皮细胞,激活端粒酶,以期建立永生化血管内皮细胞系。研究获得了以下结果:1.无菌采取猪脐带,用0.1%胶原酶消化分离内皮细胞,于37℃、5%CO2条件下培养。采用脂质体转染法,将编码hTERT的真核表达质粒pCIneo-hTERT导入原代培养的猪脐静脉细胞。隔天后加G418筛选,约1个月后,抗性细胞克隆形成,滤纸片法转移、扩增,hTERT稳定转染入细胞,同时细胞端粒酶活性转为阳性。细胞在体外长期连续培养下生长良好,已传至15代。2.对转染后细胞进行蛋白表达及增殖等生物学的观察。结果表明,70%细胞在24h内贴壁,3～4d长成单层,典型铺路石状。转染后内皮细胞F-ⅧAg和CD34免疫荧光染色鉴定为阳性,第15代内皮细胞端粒酶活性检测为阳性。细胞计数绘制细胞生长曲线,表明培养过程中细胞生长具有典型的S特征。证明转染后的猪脐静脉血管内皮细胞保留了原代内皮细胞的生物学特征。以上结果表明,本试验成功的将脂质体介导的hTERT转染入猪脐静脉血管内皮细胞,hTERT转染可以延长猪血管内皮细胞的寿命,由于时间的限制,现传至15代,为猪脐静脉血管内皮细胞的永生化奠定了基础。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-10
文献综述  10-27
  第一章永生化细胞的研究进展  10-19
    1.1 关于细胞的衰老、危机和永生化  10-12
      1.1.1 衰老  10-11
        1.1.1.1 复制性衰老  10-11
        1.1.1.2 氧化损伤  11
        1.1.1.3 原癌基因激活  11
      1.1.2 危机  11
      1.1.3 永生化  11-12
    1.2 促使细胞永生化的方法  12-15
      1.2.1 病毒  12-14
        1.2.1.1 SV40  12
        1.2.1.2 EB 病毒  12-13
        1.2.1.3 人乳头瘤病毒  13
        1.2.1.4 其他病毒  13-14
      1.2.2 放射性因素  14
      1.2.3 P53 突变体  14
      1.2.4 癌基因、原癌基因  14-15
      1.2.5 端粒酶  15
    1.3 基因转染  15
    1.4 永生化的分子学机制  15-17
      1.4.1 P53 基因和P53 蛋白  16
      1.4.2 PRB  16-17
    1.5 永生化细胞的检测方法  17-18
      1.5.1 检测外源基因在细胞中的整合及表达情况  17
      1.5.2 端粒酶活性的检测  17
      1.5.3 永生化细胞表面抗原的检测  17-18
      1.5.4 永生化细胞功能的检测  18
    1.6 已建成的永生化细胞系  18-19
  第二章端粒酶结构与功能的研究进展  19-27
    2.1 端粒与端粒酶  19-20
    2.2 端粒的结构功能及其遗传动力学  20-21
    2.3 端粒酶的结构与功能  21-25
      2.3.1 端粒酶的 RNA 组分(TR )  22
      2.3.2 端粒酶相关蛋白  22-23
      2.3.3 端粒酶的催化亚单位  23-25
        2.3.3.1 端粒酶催化亚单位的基因结构  23
        2.3.3.2 端粒酶催化亚单位的功能  23-25
        2.3.3.3 端粒酶催化亚单位的激活  25
    2.4 无端粒酶活性的永生化细胞的端粒维持  25
    2.5 端粒和端粒酶与细胞永生化的关系  25-27
试验研究  27-42
  第三章 HTERT 质粒的提取纯化及鉴定  27-32
    3.1 材料  27-28
      3.1.1 质粒PCINEO-HTERT  27
      3.1.2 大肠杆菌DH5Α  27
      3.1.3 限制性内切酶ECORI, SAL I  27
      3.1.4 DNA MARKER  27
      3.1.5 0.1MOL/L CACL2 溶液  27
      3.1.6 TE（PH8.0）  27-28
      3.1.7 LB 培养基  28
      3.1.8 LB 平板（含氨苄青霉素）  28
      3.1.9 50×TAE 溶液（贮存液）  28
      3.1.10 1000×氨苄青霉素  28
      3.1.11 主要仪器设备  28
    3.2 方法  28-29
      3.2.1 质粒DNA 的转化、扩增和纯化  28-29
        3.2.1.1 大肠杆菌感受态细胞的制备  28-29
        3.2.1.2 细菌转化  29
        3.2.1.3 质粒提取和纯化  29
        3.2.1.4 质粒定量和酶切鉴定  29
    3.3 结果  29-30
      3.3.1 质粒扩增和酶切鉴定  29-30
    3.4 讨论  30-31
    3.5 小结  31-32
  第四章转入端粒酶逆转录酶基因使猪脐静脉血管内皮细胞永生化的初步研究  32-42
    4.1 材料  32-34
      4.1.1 新鲜猪脐带  32
      4.1.2 培养基  32
      4.1.3 血清  32
      4.1.4 下丘脑粗提物  32
      4.1.5 肝素  32-33
      4.1.6 3%谷氨酰胺  33
      4.1.7 抗生素  33
      4.1.8 缓冲液  33
        4.1.8.1 PBS 液  33
        4.1.8.2 D-Hank’s 液  33
      4.1.9 消化液  33-34
        4.1.9.1 胶原酶  33
        4.1.9.2 ATV（Antibiotic trypsin versen）使用液  33-34
        4.1.9.3 脂质体Lipofect AMINE 2000 Reagent 转染试剂盒(Invitrogen)  34
      4.1.10 G418  34
      4.1.11 端粒酶活性检测试剂盒  34
      4.1.12 间接免疫荧光试剂  34
      4.1.13 主要仪器设备  34
    4.2 方法  34-37
      4.2.1 细胞培养  34-35
        4.2.1.1 培养液的准备  34-35
        4.2.1.2 猪脐静脉血管内皮细胞的分离  35
        4.2.1.3 脐静脉血管内皮细胞的原代培养  35
        4.2.1.4 血管内皮细胞的传代培养  35
      4.2.2 基因转染和细胞克隆的筛选  35-36
        4.2.2.1 基因转染  35-36
        4.2.2.2 细胞克隆和筛选  36
      4.2.3 端粒酶活性的检测  36
      4.2.4 细胞生长曲线  36
      4.2.5 F-ⅧAG 和CD34 检测  36-37
    4.3 结果  37-39
      4.3.1 基因转染和细胞培养  37-38
      4.3.2 形态学观察  38
        4.3.2.1 转染后细胞形态  38
      4.3.3 端粒酶活性  38
      4.3.4 生长曲线  38-39
      4.3.5 Ⅷ因子和CD34 检测  39
    4.4 讨论  39-41
    4.5 小结  41-42
结论  42-43
参考文献  43-49
缩略词  49-50
致谢  50-51
个人简介  51

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