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兔出血症病毒反向遗传研究系统的建立

作　者: 张玉颖
导　师: 吴润；刘光清
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 反向遗传系统兔病出血症病毒(RHDV) 遗传标记感染性cDNA分子克隆
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

应用反向遗传系统实现RNA病毒的拯救,从而可以在DNA水平上对RNA病毒进行遗传操作,为深入研究RNA病毒的分子生物学及病毒与宿主的相互作用提供了强有力的技术工具。对RNA病毒进行遗传拯救或构建感染性克隆己成为分子病毒学实验室进行病毒结构与功能深入研究的必经之路。兔出血症(RHD)是由兔出血症病毒(RHDV)引起的兔的一种急性﹑败血性﹑高度致死性传染病,是危害世界养兔业的严重传染病之一。本研究选择兔出血症病毒JX/97分离株,克隆其全基因组cDNA,在国内首次尝试构建RHDV反向遗传系统,拯救经过分子标记的RHDV。1.RHDV JX/CHA/97株全长cDNA分子克隆的构建设计并合成了覆盖JX/CHA/97株基因组的5对引物,从人工感染RHDV致死的兔肝组织中提取病毒总RNA,采用RT-PCR方法分别扩增各基因片段。通过沉默突变引入一分子标记(EcoR V识别位点)以便于将来区分自然毒株和基因工程毒。利用限制性内切酶,分别消化各基因扩增片段和pBluescript II SK(+)(即pSK)载体,构建JX/97株基因组的全长cDNA分子克隆(pBlRHDV)。分别采用PCR法﹑限制性内切酶酶切法和基因组测序法对pBlRHDV进行鉴定,结果表明已成功构建了RHDV JX/97株的全长cDNA分子克隆。它不仅含有JX/97株的全基因组序列,还含有SP6启动子序列﹑一个分子标记(EcoR V识别位点)和引物设计中添进的限制性酶切位点。2. RHDV JX/CHA/97株全长cDNA分子克隆(pBlRHDV)感染性的鉴定用Nru I将pBlRHDV线形化后,以之做模板,使用RiboMAXTM Large Scale RNA Production Systems-SP6聚合酶系统进行体外转录,得到病毒RNA。用脂质体转染法将转录物导入RK-13细胞,24h后可观察到典型的RHDV致细胞病变效应。分别使用RT-PCR、皮下和腹腔接种SPF健康兔以及免疫电镜观察等方法进行鉴定,结果表明拯救病毒成功,获得了感染性cDNA分子克隆。通过对感染性分子克隆分子标志的鉴定,排除了自然毒株的污染。总之,RHDV反向遗传研究系统的建立将为深入研究其功能基因组学以及致病和变异的分子机制奠定基础,同时还具备研制新一代基因缺失疫苗和标记疫苗的潜在应用前景。

全文目录

摘要  3-4
Summary  4-9
第一篇文献综述  9-32
  第一章兔出血症病毒研究进展  9-21
    0 前言  9
    1 RHDV 生物学特性  9-10
      1.1 形态学特性  9-10
      1.2 理化及血凝特性  10
      1.3 分离培养  10
    2 RHDV 基因组结构及其功能  10-11
      2.1 RHDV 基因组  10-11
      2.2 RHDV 亚基因组  11
    3. RHDV 的结构蛋白与非结构蛋白  11-16
      3.1 结构蛋白  11-13
        3.1.1 VP60  11-13
        3.1.2 VP10  13
      3.2 非结构蛋白  13-16
        3.2.1 2C解旋酶  13
        3.2.2 Vpg  13-14
        3.2.3 3C样蛋白酶  14-15
        3.2.4 RdRp  15-16
    4. 病毒的变异性  16
    5. 诊断检测  16-17
    6. 结语  17
    参考文献  17-21
  第二章 RNA 病毒的反向遗传学  21-32
    0 前言  21
    1 反向遗传学的发展历程  21-23
    2 RNA病毒反向遗传学操作技术的策略  23
    3 正链RNA病毒的反向遗传学操作  23-27
      3.1 构建病毒基因组全长cDNA克隆  23-24
      3.2 感染性转录物的产生  24-25
        3.2.1 体内转录  24
        3.2.2 体外转录  24-25
      3.3 影响构建感染性克隆的限制性因素  25-26
      3.4 感染性克隆的产生与鉴定  26-27
    4 病毒的拯救  27-28
    5 反向遗传操作技术的应用与展望  28-29
      5.1 病毒基因组功能的研究  28
      5.2 新型疫苗的研究  28
      5.3 将 RNA 病毒改造成载体  28-29
      5.4 基因治疗  29
    6 结语  29
    参考文献  29-32
第二篇研究报告  32-53
  第三章兔出血症病毒全长cDNA 的构建  32-44
    0 前言  32-33
    1 材料与方法  33-39
      1.1 材料  33
        1.1.1 病毒株、菌种、载体  33
        1.1.2 实验动物  33
        1.1.3 主要酶类和生物试剂  33
        1.1.4 主要仪器与设备  33
      1.2 方法  33-39
        1.2.1 病毒的增殖  33
        1.2.2 引物的设计与合成  33
        1.2.3 载体的选用  33
        1.2.4 RHDV JX/CHA/97 株基因组全序列的分段扩增  33-36
          1.2.4.1 病毒总RNA的提取  34
          1.2.4.2 cDNA第一链的合成  34-35
          1.2.4.3 PCR扩增  35
          1.2.4.4 PCR产物的纯化与回收  35-36
        1.2.5 RHDV JX/CHA/97 株全长cDNA 分子的装配及鉴定  36-39
          1.2.5.1 5’半分子的构建  36-37
          1.2.5.2 3’半分子的构建  37-38
          1.2.5.3 RHDV JX/97株全长cDNA重组质粒的构建  38-39
    2 结果与分析  39-41
      2.1 RHDV JX/CHA/97 株的全基因组序列各片段的扩增  39
      2.2 重组质粒的鉴定  39-40
        2.2.1 重组质粒的电泳鉴定  39
        2.2.2 pBlDf 和pBlABDf 重组质粒的酶切鉴定  39-40
        2.2.3 pBlRHDV 重组质粒的 PCR 和酶切鉴定  40
          2.2.3.1 酶切鉴定  40
          2.2.3.2 PCR 法鉴定  40
      2.3 全长cDNA 的序列测定  40-41
    3 讨论  41-43
    参考文献  43-44
  第四章 RHDV 全长cDNA 分子克隆感染性的鉴定  44-53
    0 前言  44
    1 材料和方法  44-48
      1.1 材料  44-45
        1.1.1 质粒﹑细胞  44-45
        1.1.2 主要试剂  45
        1.1.3 主要仪器和设备  45
      1.2 方法  45-48
        1.2.1 pBlRHDV 重组质粒的提取  45
        1.2.2 pBlRHDV 重组质粒的线性化  45
        1.2.3 体外转录物 RNA 的制备  45-46
        1.2.4 体外转录物 RNA 完整性检测  46
          1.2.4.1 溶液配制  46
          1.2.4.2 变性琼脂糖凝胶电泳  46
        1.2.5 动物体内RHDV病毒粒子的拯救  46-47
          1.2.5.1 接种病毒 RNA  46
          1.2.5.2 病毒粒子的检测  46-47
        1.2.6 细胞水平上 RHDV 病毒粒子的拯救  47-48
          1.2.6.1 转染 RK-13 细胞  47
          1.2.6.2 细胞内拯救病毒的鉴定  47-48
    2 结果与分析  48-50
      2.1 体外转录物 RNA 完整性检测  48-49
      2.2 动物体内 RHDV 病毒粒子的拯救  49
        2.2.1 动物接种试验  49
        2.2.2 RT-PCR 法检测病毒粒子  49
        2.2.3 基因工程病毒与自然毒株的区别鉴定  49
      2.3 转染 RK-13 细胞结果  49-50
        2.3.1 RK-13 细胞的病变效应  49-50
        2.3.2 电镜观察检验结果  50
        2.3.3 IFA 检测病毒抗原表达  50
        2.3.4 RT-PCR 检测病毒基因组  50
        2.3.5 病毒复制的检测  50
    3 讨论  50-52
    参考文献  52-53
论文结论  53-54
致谢  54-55
作者简介  55-56
导师简介  56-57

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