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化学诱变法选育片球菌素高产乳酸片球菌菌株的研究

作　者: 李静
导　师: 周志江
学　校: 天津大学
专　业: 食品科学
关键词: 片球菌素乳酸片球菌化学复合诱变
分类号: TS201.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

乳酸菌细菌素是食品级微生物的代谢产物,有些已作为食品防腐剂用于食品保藏。片球菌素(pediocin)是既nisin以来最有可能投入生产的乳酸菌细菌素,但由于片球菌素产生菌多为野生菌株,产量低下的缺点给研究带来不便,无法满足工业生产的要求。本研究是以本研究室从国内发酵食品中分离出的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)PA003为研究对象,通过化学复合诱变的方法进行诱变育种,以期获得高产片球菌素的突变菌株,适用于今后的实验室研究和工业生产。为快速准确测定片球菌素效价,本研究采用了三种片球菌素效价测定和定量的方法:质量称重法,用于规模化生产过程中片球菌素产量测定;牛津杯双层平板法,测定结果较准确,用于突变菌株的初筛过程;分光光度法,测试时间短,主要用于高产片球菌素菌株最适生产条件探索过程。本研究采用硫酸二乙酯和LiCl复合诱变的方法对片球菌Pediococcus acidilactici PA003进行诱变育种。正交试验确定DES最佳诱变条件为片球菌菌液浓度为107cfu/mL,DES浓度为0.8%,诱变时间为30min,诱变温度为37℃,试验中共获得20个片球菌素产量提高的突变菌株。挑选产量提高幅度最大的五株继续进行LiCl诱变育种试验,从中进一步筛选出5株产量提高的突变菌株,其中突变菌株P2的效价为菌株Pediococcus acidilactici PA003效价的24.15倍。本研究进而对影响上述突变菌株P2产片球菌素的因素进行了研究。通过单因素试验确定培养基初始pH值、接种量、培养温度、培养时间为主要影响因素;运用Design Expert 7.1.6中的Box-Behnken设计法,得到回归方程的预测模型并进行响应面分析,确定突变菌株P2产片球菌素最适生产条件为初始pH值6.5、培养时间17.5h、初始温度37℃、接种量0.5%。此条件下培养突变菌株P2,其效价是普通条件下突变菌株P2产片球菌素效价的1.12倍。突变菌株P2经过20代的连续斜面传代试验,片球菌素产量保持稳定,第20代产片球菌素效价下降2.3%左右,遗传稳定性良好。片球菌素具有被开发为安全和高效生物食品防腐剂的巨大潜力,本研究获得的高产片球菌素突变菌株P2有望用于片球菌素的工业化生产,并取得良好的经济和社会效益。

全文目录

摘要  3-4
ABSTRACT  4-9
前言  9-10
第一章文献综述  10-30
  1.1 课题的研究背景  10-11
    1.1.1 生物食品防腐剂的研究现状  10-11
    1.1.2 乳酸菌细菌素的研究动态  11
  1.2 细菌素的综述  11-17
    1.2.1 细菌素的定义  11-12
    1.2.2 细菌素的分类  12-14
    1.2.3 细菌素的结构及理化性质  14-15
    1.2.4 细菌素的抑菌机理  15
    1.2.5 细菌素的抑菌谱  15-17
    1.2.6 细菌素在食品工业中的应用  17
  1.3 片球菌素研究进展  17-22
    1.3.1 片球菌素的结构及理化性质  17-19
    1.3.2 片球菌素的发酵条件  19-20
    1.3.3 片球菌素的提取纯化  20-22
    1.3.4 片球菌素的应用前景  22
  1.4 研究内容和方法  22-28
    1.4.1 片球菌素的效价测定  22-24
    1.4.2 片球菌素高产菌株的诱变及筛选  24-26
    1.4.3 各种因素对片球菌素效价的影响  26
    1.4.4 高产片球菌素菌株培养条件的优化和遗传稳定性  26-28
  1.5 高产片球菌素菌株研究的目的及意义  28-30
第二章片球菌素的纯化和效价分析  30-44
  2.1 试验材料与仪器  30-32
    2.1.1 仪器设备  30
    2.1.2 主要菌种  30-31
    2.1.3 培养基  31
    2.1.4 药品和试剂  31-32
  2.2 试验方法  32-35
    2.2.1 考马斯亮蓝法测定片球菌素稀释液浓度  32-33
    2.2.2 片球菌素的提取纯化及冷冻干燥  33
    2.2.3 牛津杯双层平板法测定片球菌素效价  33-34
    2.2.4 分光光度法测定片球菌素效价  34-35
  2.3 结果与讨论  35-43
    2.3.1 片球菌素稀释液浓度测定  35-36
    2.3.2 片球菌素提取纯化和冷冻干燥  36-37
    2.3.3 牛津杯双层平板法测定结果  37-39
    2.3.4 分光光度法测定结果  39-43
  2.4 小结  43-44
第三章片球菌素高产菌株的诱变及筛选  44-57
  3.1 试验材料与仪器  44-45
    3.1.1 主要菌种  44
    3.1.2 主要仪器  44
    3.1.3 培养基及主要试剂  44-45
  3.2 试验方法  45-48
    3.2.1 片球菌Pediococcus acidilatici PA003 菌种活化和生长曲线测定  45-46
    3.2.2 DES 对菌株Pediococcus acidilatici PA003 的化学诱变  46-47
    3.2.3 LiCl 对突变株的化学诱变  47
    3.2.4 菌株致死率的确定  47-48
    3.2.5 片球菌素效价分析及菌株筛选  48
  3.3 结果与讨论  48-56
    3.3.1 片球菌Pediococcus acidilatici PA003 生长曲线测定结果  48-49
    3.3.2 DES 对菌株Pediococcus acidilatici PA003 的诱变结果  49-53
    3.3.3 LiCl 对突变株的诱变结果  53-56
  3.4 小结  56-57
第四章高产菌株的最适生产条件优化及遗传稳定性研究  57-74
  4.1 试验材料与仪器  57-59
    4.1.1 培养基和主要试剂  57-58
    4.1.2 主要仪器  58
    4.1.3 主要菌种  58-59
  4.2 试验方法  59-61
    4.2.1 突变菌株P2 产片球菌素最适生产条件的单因素试验  59-60
    4.2.2 响应面法优化突变菌株P2 产片球菌素的生产条件  60
    4.2.3 突变菌株P2 产片球菌素的遗传稳定性试验  60-61
  4.3 结果与讨论  61-73
    4.3.1 突变菌株P2 产片球菌素最适生产条件的单因素试验的结果  61-66
    4.3.2 响应面法分析突变菌株P2 产片球菌素的最适生产条件  66-72
    4.3.3 遗传稳定性试验  72-73
  4.4 小结  73-74
第五章结论与展望  74-75
参考文献  75-80
致谢  80

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