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诊断工具酶的制备及其稳定性的研究

作　者: 王伟伟
导　师: 董伟
学　校: 南京理工大学
专　业: 生物化工
关键词: 胱硫醚β裂解酶溶液稳定性添加剂胰蛋白酶聚乙烯亚胺
分类号: TQ464.8
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
下　载: 62次
引　用: 2次
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内容摘要

近年来，由于基因工程和蛋白质工程的快速发展，使蛋白质类产品基本实现了产业化。但大多数蛋白质在溶液状态下不稳定，临床诊断工具酶一般是在液态情况下使用，所以解决蛋白质在溶液状态下的稳定性问题，是实现国产工具酶产业化的关键。最近研究发现，高半胱氨酸与100多种疾病相关，因此高半胱氨酸的检测成为基础医学和临床医学的新热点。胱硫醚β裂解酶(CBL)和胱硫醚β合成酶(CBS)是自动化分析仪检测高半胱氨酸的主要工具酶，本论文主要针对其中的CBL在溶液状态下的稳定性进行了研究。通过克隆大肠杆菌CBL的基因，插入pET-23a(+)和pET-28a(+)载体，构建基因工程菌进行表达，分离纯化获得CBL。然后采用胰蛋白酶对文献报导的蛋白质在溶液状态中的添加剂进行预筛选，研究了九种不同添加剂在不同浓度、不同温度条件下对胰蛋白酶溶液稳定性的影响，发现其中八种添加剂在特定条件下可以不同程度的提高胰蛋白酶的稳定性，而分子量为800，2000，25000的聚乙烯亚胺(PEI)对其稳定效果较好。在此基础上，研究这三种PEI在不同浓度，不同温度的条件下对CBL溶液的稳定效果，结果表明：PEI系列可以显著提高CBL酶的稳定性，PEI800，PEI25000的稳定效果优于PEI2000。温度不同，稳定效果最好时添加剂的浓度也不同，对于PEI800和PEI2000，4℃时，稳定效果：1％＞0.5％＞0.1％，即浓度越大，稳定效果越好；37℃时，0.1％＞0.5％＞1％，即浓度越小，稳定效果越好；PEI25000只在0.1％有稳定效果。比较发现，4℃时，1％的PEI800的稳定效果相对比较好，37℃时，0.1％的PEI25000的稳定效果相对比较好。没有加入PEI稳定剂，CBL酶在一个月后酶活完全失去，而加入PEI稳定剂后，CBL酶活性在4℃和37℃分别保持了53.8％和35.3％。

全文目录

1 引言  7-19
  1.1 蛋白质的不稳定性  7-11
    1.1.1 化学不稳定性  8-10
    1.1.2 物理不稳定性  10-11
  1.2 影响蛋白质不稳定的因素  11-13
    1.2.1 影响蛋白质聚集的因素  11-12
    1.2.2 导致蛋白质凝聚的处理  12-13
  1.3 蛋白质稳定性的改善  13-16
    1.3.1 蛋白质聚集抑止  13-15
    1.3.2 改善蛋白质稳定性的方法  15-16
  1.4 本课题的研究意义  16-17
  1.5 本论文研究内容  17-19
2 CBL的制备  19-39
  2.1 实验试剂与仪器  20-26
    2.1.1 实验试剂  20
    2.1.2 实验仪器  20-21
    2.1.3 菌株和质粒  21-23
    2.1.4 PEI23a(+)-CBL构建示意图  23-24
    2.1.5 PEI28a(+)-CBL构建示意图  24-25
    2.1.6 PEI28a(+)-CBL构建示意图  25-26
  2.2 实验方法  26-35
    2.2.1 CBL酶基因的PCR扩增  26-27
    2.2.2 PCR产物的回收  27
    2.2.3 PCR产物与pET23a(+)&pET28a(+)载体的双酶切  27
    2.2.4 双酶切产物的回收  27
    2.2.5 双酶切回收产物的连接  27-28
    2.2.6 大肠杆菌 TOP10感受态的制备  28-29
    2.2.7 连接产物转化 TOP10感受态细胞  29
    2.2.8 质粒的提取  29-30
    2.2.9 重组质粒的 PCR鉴定  30-31
    2.2.10 蛋白的表达  31
    2.2.11 蛋白分离纯化  31-33
    2.2.12 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白表达结果  33-35
  2.3 结果和分析  35-38
    2.3.1 CBL基因的克隆  35
    2.3.2 重组质粒pET-23a(+)-CBL或pET-23a(+)-CBL的PCR鉴定  35-36
    2.3.3 CBL的 SDS-PAGE检测结果  36
    2.3.4 镍柱纯化  36-37
    2.3.5 CBL酶活的测定  37-38
  2.4 结果和讨论  38-39
3 胰蛋白酶在溶液状态下稳定性的研究  39-51
  3.1 实验试剂与仪器  39-40
    3.1.1 实验试剂  39-40
    3.1.2 实验仪器  40
  3.2 实验方法  40-50
    3.2.1 胰蛋白酶酶活的测定  40-41
    3.2.2 稳定性研究的方法  41-45
    3.2.3 稳定性研究的结果和讨论  45-50
  3.3 结果和讨论  50-51
4 CBL在溶液状态下稳定性的研究  51-59
  4.1 实验试剂与仪器  51
    4.1.1 实验试剂  51
    4.1.2 实验仪器  51
  4.2 实验方法  51-58
    4.2.1 稳定性研究的方法  51-53
    4.2.2 稳定性研究的结果和讨论  53-58
  4.3 结果和讨论  58-59
结论  59-60
致谢  60-61
参考文献  61-67

诊断工具酶的制备及其稳定性的研究

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