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芋螺多肽conantokins构效关系研究及中国南海织锦芋螺毒素的分离鉴定

作　者: 肖彩
导　师: 林原斌；戴秋云
学　校: 湘潭大学
专　业: 有机化学
关键词: 睡眠肽合成纯化镇痛活性织锦芋螺分离氧化折叠
分类号: R99
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

芋螺毒素由芋螺毒液管和毒囊内壁的毒腺分泌,多数由12~40个氨基酸组成,富含二硫键。与其他天然肽类毒素相比,芋螺毒素具有分子量小、结构稳定、高活性、高选择性及易于合成等突出优点。它们能特异性作用于乙酰胆碱受体及其它神经递质的各种受体亚型,及钙、钠、钾等多种离子通道,不仅可以直接作为药物,还可作为理想的分子模板用于发展新药先导化合物,对研究神经生物学也具有重要意义。本论文旨在研究conantokins及其类似物的镇痛活性,分离中国南海芋螺毒素,以及研究含一对及三对二硫键的芋螺多肽的合成及氧化折叠。在conantokins及其类似物的合成、纯化及镇痛实验研究中:(1)合成了用于合成conantokins及其类似物的Fomc-Gla(tBu)2-COOH 10 g纯品;(2)在conantokins的合成中,针对某些难以耦合的氨基酸部位采用延长耦合时间来提高反应产率,合成了con-G、con-T、con-Qu及10个conantokins类似物;(3)采用凝胶层析、离子交换及RP-HPLC相结合的纯化方式对合成的conantokins进行了纯化,纯度均达到85%以上;(4)测定了conantokins及其突变体的镇痛活性,结果表明con-G的类似物con-G[S16Y]的镇痛活性显著高于其他conantokins及类似物,且镇痛活性与conantokins及类似物的NR2B亚基选择性有关。系统分离鉴定了中国南海织锦芋螺的毒素组分,共获得了11个芋螺毒素,其中4个为新芋螺毒素,7个与已报道的相同。这些已知的毒素序列主要由Olivera B M等人通过cDNA克隆或分离获得,采用的织锦芋螺采自菲律宾宿务岛(Cebu)、马尼拉岛(Marinduquc)以及越南(Vietnam)周边地区,这些地区均濒临我国南海。通过序列对比及毒素成分对比,我们所采集的织锦芋螺品种与Olivera B M所采集的品种相近。分析比较主要织锦芋螺毒素的蛋白序列特征,观察到中国南海织锦芋螺中含有丰度很高的M族芋螺毒素,且序列较短。为进一步研究芋螺毒素的结构及其他功能,我们又合成了含一对及三对二硫键的芋螺多肽,对其氧化折叠条件进行了研究。采用DMSO氧化体系合成了含一对二硫键的conantokins衍生物,采用不同助氧化还原系统,如L-半胱氨酸(Cys)、氧化型/还原型谷胱甘肽(GSSG/GSH)、二巯基苏糖醇(DTT)等,合成了含有三对二硫键的N-钙通道抑制剂SO-3的突变体SO-3[A3S,A4K,A12M],并对折叠的其他条件(如离子强度,温度等)进行了优化。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-10
第一章引言  10-19
  1.1 芋螺毒素研究概况  10
  1.2 Conantokins研究进展  10-15
  1.3 织锦芋螺毒素研究进展  15-17
  1.4 芋螺多肽的合成方法  17-18
  1.5 本论文的研究目的及意义  18-19
第二章 NMDA受体拮抗剂conantokins合成纯化及镇痛实验研究  19-36
  2.1 实验部分  19-34
    2.1.1 主要试剂与仪器  19-21
    2.1.2 γ,γ’-二叔丁基-L-N~α-9-芴甲氧羰基-γ-羧基谷氨酸的合成  21-24
    2.1.3 Conantokins（睡眠肽）的合成  24-27
    2.1.4 Conantokins的纯化  27-29
    2.1.5 Conantokins的表征  29-30
    2.1.6 Conantokins活性评价-小鼠药理实验  30-34
  2.2 结果与讨论  34-36
    2.2.1 γ,γ’-二叔丁基-L-N~α-9-芴甲氧羰基-γ-羧基谷氨酸的合成  34
    2.2.2 Conantokins及其类似物的合成  34-35
    2.2.3 Conantokins的纯化  35
    2.2.4 Conantokins的镇痛活性与结构的关系  35-36
第三章中国南海织锦芋螺毒素的分离纯化  36-44
  3.1 实验部分  36-42
    3.1.1 织锦芋螺毒素的分离  36-42
  3.2 结果与讨论  42-44
    3.2.1 芋螺毒素分离鉴定方法的比较  42
    3.2.2 织锦芋螺毒素的序列特点  42-43
    3.2.3 织锦芋螺毒素序列的确定  43-44
第四章含一对及三对二硫键的芋螺多肽的合成及氧化折叠  44-50
  4.1 实验部分  44-49
    4.1.1 含链间一对二硫键的芋螺毒素coantokins衍生物的合成  44-46
    4.1.2 含三对二硫键的O-芋螺毒素SO-3 [A~3S,A~4K,A~(12)M]的合成  46-49
  4.2 结果与讨论  49-50
    4.2.1 分子间二硫键的形成  49
    4.2.2 分子内二硫键的形成  49-50
结论  50-51
参考文献  51-55
致谢  55-56
附录A（攻读学位期间发表论文目录）  56-57
附录B（附加数据）  57-59

芋螺多肽conantokins构效关系研究及中国南海织锦芋螺毒素的分离鉴定

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