学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

SEB基因的膜片电极支撑双层类脂膜核酸传感器研究

作　者: 刘楠
导　师: 高志贤
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 营养与食品卫生学
关键词: SEB基因双层类脂膜(BLMs) 膜片钳核酸传感器原子力显微镜(AFM)
分类号: Q789
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
下　载: 31次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

由金黄色葡萄球菌肠毒素B基因所编码的B型肠毒素（Staphylococcus aureus entoxin B，SEB）是引起食物中毒的重要毒素，也是重要的生物战剂之一，本文以SEB基因为检测目标基因，以固定有特异识别SEB基因的寡核苷酸探针的双层类脂膜（BLMs）为敏感分子识别元件；利用膜片钳放大器系统对细胞膜上离子通道跨膜电流变化极其灵敏的特点，研究并构建一种新型的膜片电极支撑BLMs核酸传感器，对SEB基因进行快速、灵敏和特异的检测。主要研究内容如下： 1．优化了成膜液的组成及配比，研究了新型膜片电极支撑的双层类脂膜的制备。用膜片钳系统记录BLMs在膜片电极尖端形成的I-V直线图并可在光学显微镜下（10×40）观察成膜后的情况。用在膜中嵌入短杆菌肽离子通道蛋白的方法，对所制备BLMs的真实性进行确证。 2．利用生物信息学方法设计了对SEB基因有良好特异互补配对的寡核苷酸探针，采用直链烷烃链C₁₂对其5’端进行修饰(C₁₂-ssDNA)，可提高探针在BLMs上的固定能力。 3．研究了序列不同的寡核苷酸探针及不同浓度C₁₂-ssDNA探针在膜片电极支撑BLMs上固定所产生的电流响应情况。C₁₂修饰过的探针响应远较未修饰的良好。50mV静电位下，电流响应值和不同浓度的寡核苷酸探针呈正相关。实验选定以浓度为273.65ng／mL的C₁₂-ssDNA固定于BLMs上作为膜片电极支撑BLMs核酸传感器的生物敏感元件。传感器测得的电流与施加阶跃电压呈良好的线性关系。 4．对膜片电极支撑BLMs核酸传感器检测SEB基因进行研究。传感器可定量检测SEB基因的范围是20～5000ng／mL。在特异性检测方面，传感器对其它金葡菌株和食品污染致病菌菌株的基因组DNA无明显电信号反应。同时，对传感器BLMs表面微观结构，即空白BLMs、固定寡核苷酸探针的BLMs和杂交洗脱后的BLMs分别进行AFM扫描和比较。 5．在以上工作基础上，本研究制备的BLMs核酸传感器对污染牛奶样品中产SEB金黄色葡萄球菌菌量的最低检测限为10²cfu／mL，可初步用于对菌量的定量检测。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-9
第一章绪论  9-21
  1.1 引言  9-10
  1.2 生物传感器  10-12
  1.3 膜片钳技术研究概况  12-13
  1.4 双层类脂膜及双层类脂膜核酸传感器研究进展  13-15
  1.5 金黄色葡萄球菌、肠毒素及其SEB基因检测研究概况  15-21
第二章膜片电极支撑BLMs的制备  21-39
  2.1 引言  21-25
  2.2 膜片电极的制作  25-26
  2.3 BLMs在膜片电极尖端形成的条件选择  26-33
    2.3.1 成膜液构成比例的优化  26-29
    2.3.2 生物活性物质的嵌入选择  29-31
    2.3.3 膜片钳系统的参数选择  31-33
  2.4 BLMs的制备  33-38
    2.4.1 试剂和仪器  33
    2.4.2 BLMs的制备过程  33-35
    2.4.3 BLMs形成的I-V直线图  35-37
    2.4.4 重复性测定  37
    2.4.5 BLMs形成的验证实验——Gramicidin法  37-38
  2.5 小结  38-39
第三章靶基因的制备和探针的设计与特异性研究  39-51
  3.1 引言  39-40
  3.2 材料与方法  40-44
    3.2.1 试剂和仪器  40-42
    3.2.2 实验方法  42-44
  3.3 结果与讨论  44-50
    3.3.1 实验菌株的培养及鉴定  44-45
    3.3.2 金葡菌基因组DNA的提取  45
    3.3.3 SEB靶基因特异性分析  45-49
    3.3.4 探针的特异性研究  49-50
  3.4 小结  50-51
第四章膜片电极支撑BLMs核酸传感器的构建技术研究  51-58
  4.1 引言  51-52
  4.2 材料与方法  52-54
    4.2.1 试剂和仪器  52-53
    4.2.2 实验方法  53-54
  4.3 结果与讨论  54-57
    4.3.1 不同ssDNA探针在阶跃电压下的电流响应研究  54-55
    4.3.2 不同浓度寡核苷酸探针在膜片电极支撑BLMs上的固定研究  55-56
    4.3.3 施加阶跃电压后ssDNA在BLMs上的固定  56-57
  4.4 小结  57-58
第五章膜片电极支撑BLMs核酸传感器检测SEB基因研究及初步应用  58-75
  5.1 材料与方法  58-59
    5.1.1 实验所用菌株和仪器  58
    5.1.2 实验方法  58-59
  5.2 灵敏度测定  59-60
  5.3 特异度测定  60-64
  5.4 BLMs表面微观结构的AFM扫描  64-69
    5.4.1 原子力显微镜操作  66-67
    5.4.2 原子力显微镜各参数选择  67
    5.4.3 原子力显微镜对各种状态下BLMs表面微观结构的观察  67-69
  5.5 膜片电极支撑BLMs核酸传感器检测牛奶中产SEB金葡菌  69-72
  5.6 讨论  72-73
  5.7 小结  73-75
第六章总结  75-77
  6.1 论文完成的主要工作  75
  6.2 展望  75-77
参考文献  77-84
致谢  84-85
在学期间发表的学术论文  85

SEB基因的膜片电极支撑双层类脂膜核酸传感器研究

内容摘要

全文目录

相似论文