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孕酮对P2X_3受体介导的外周痛觉信号转导的快速抑制作用

作　者: 樊娟
导　师: 马蓓
学　校: 第二军医大学
专　业: 生理学
关键词: 孕激素 P2X受体 ATP 全细胞膜片钳痛觉
分类号: R402
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

疼痛是人体各部分受到损伤性刺激引起的不愉快的感觉,它提供躯体受到威胁的警报信号,是生命不可缺少的一种特殊保护功能。但另一方面,严重的慢性疼痛困扰着数以百万计的人们,是临床的一大难题。因而了解疼痛产生的机制,寻找解除疼痛的方法,是医学领域亟待解决的问题。临床观察早就注意到疼痛有明显的性别差异,主要表现在两个方面:1)肠激惹综合征、间质性膀胱炎、颞下颌关节炎等病症多见于女性;2)这些疾病症发生和发展与月经周期相关。这些证据表明性激素可能参与痛觉的调节。传统观点认为孕酮(progesterone, PROG)主要由卵巢和胎盘产生,与雌激素共同维持女性的生理周期和生理特征,然而越来越多的研究表明,孕酮除了参与生殖功能外,还可以在神经系统中合成和分泌,从而影响神经系统的功能,是神经系统中一种重要的信号分子。近年来临床、流行病学及实验室研究均发现疼痛存在性别差异,除了与雌激素水平紧密相关外,还与两性体内孕酮水平的差异有关联,因而孕酮及其受体在疼痛调节中的可能作用及机制正日益受到更多地关注。孕激素是一种脂溶性激素,它可以通过激活靶细胞核内受体(即PRA和PRB),影响靶基因转录。这种作用往往牵涉到新蛋白的合成,需要较长的潜伏期,称为激素的基因组作用。另一方面,孕激素还可以作用于可能存在于细胞膜上的受体,介导快速效应,称为激素的非基因组作用。目前已发现,孕酮受体?广泛分布于DRG初级传入神经元和外周组织细胞,提示孕激素可能影响感觉信号在传入神经末梢的转导过程。ATP不仅是一种贮能、供能物质,还是一种细胞间信息传递物质,通过激活P2X (配基门控性非选择性阳离子通道)受体而产生广泛的生物学效应。大量的研究证明,ATP参与痛觉的信号转导与传递,表现在以下几个方面:1)伤害性刺激可以使组织细胞释放ATP;2)外源性ATP可通过激活P2X受体而引起痛觉;3)P2X受体广泛分布于感觉神经末梢和有关中枢传导通路;4)在P2X2和P2X3基因敲除小鼠,炎症性躯体痛觉明显低于对照小鼠,表明ATP是炎症性痛觉的重要介质。背根神经节(DRG)的初级感觉传入神经元是研究痛觉信号转导机制的重要模型之一。在生理条件下,DRG神经元上的P2X3受体特异性地参与痛觉的信号转导。而在炎性痛和神经损伤性痛的形成过程中,ATP及P2X3受体也起到起重要的作用。这些都说明ATP和P2X3受体是外周痛觉信号转导和传递中的重要成员。因而在本课题中,我们运用动物行为学实验、全细胞膜片钳及分子生物学等方法,从整体、细胞和受体分子水平研究孕激素对ATP介导的外周痛觉信号转导的调节作用。重点探讨正常条件下孕激素对初级感觉传入神经元上P2X3受体的功能影响,对于阐明疼痛的性别相关性,以及将来研制新一代的镇痛剂,具有重要的意义。一、实验模型和方法1.动物分组48只SD雌性大鼠购自上海西普儿—必凯公司,大鼠随机分为四组(n=12),进行药物皮下注射,分别为:生理盐水组、孕酮组、RU38486组及孕酮+RU38486组,观察各组大鼠的基础痛阈。因个别大鼠一般状况较差,每组挑出11只进行行为学实验。2.痛阈测定将测试大鼠置于特制笼中,熟悉环境30min后,给四组大鼠分别皮下注射生理盐水、孕酮(500μg)、RU38486(20μg)及孕酮(500μg)+RU38486(20μg)30 min后,再以弗莱毛刺激大鼠后足部,以大鼠抬起后肢为反应阳性。弗莱毛的力量分别为:1(0.0229 g)、2(0.494 g)、3(2.05 g)、4(4.01 g)、5(6 g)、6(8 g)、7(10.8 g)、8(12.2 g)、9(14.9 g)。从细到粗,每个力量的弗莱毛刺激左脚和右脚各一次,以大鼠抬起后肢为反应阳性。3.RT-PCR测定(1)RNA分离和cDNA合成大鼠断头致死后,迅速取出8对腰骶段DRG (L1-S2),用Trizol提取液提取总RNA,紫外分光光度计测RNA纯度(A260/280),同时行RNA定量。提取的RNA中,每样本取2μg在20μl体系中反转录成cDNA, -20℃保存,用于实时定量聚合酶联反应扩增孕酮受体基因.(2)RT-PCR用于扩增mPRα基因的引物对为:CTGGAAGCCGTACATCTATGC (正义), GAAGCTGTAATGCCAGAACTC(反义);反应条件为:95℃,3min,95℃,35s;62℃,10s ; 72℃, 10s。用于扩增mPRβ基因的引物对为: AAGAAGGCCAGCCCTGCTGGTAC(正义); TTTGTGGAGGCAGGGGCATT(反义),反应条件为:95℃,3min,95℃,35s;62℃,10s;72℃,10s。用于扩增PMRγ,基因的引物对为:AGTTCCGCCACTGCCTGCAT(正义) CCGGGGCTTCTGGAGTTCAA (反义),反应条件为:95℃,3min,95℃,35s;62℃,10s;72℃,10s。4.大鼠DRG分离培养细胞的全细胞膜片钳记录将酶解得到的DRG分离细胞置入记录小室,并以1ml/min的速度用细胞外液灌流。常温下进行全细胞膜片钳记录,所用仪器为Axopatch 200B放大器。钳制电压为-60mV。记录膜电流应用低通滤波(10KHz,-3dB)。数据用pClamp9.0记录并处理。用EXCEL进行t检验。原始图用Clampfit (pCLAMP software)记录并用Origin7绘图。所有的药物稀释后通过ALA-VM8灌流系统给予,其中一管给予正常Kreb’s液,用来快速终止给药。激动剂每次给予4s,间隔2min。灌流用外液成分(mmol/L): NaCl 154, KCl 4.7, MgCl2 1.2, CaCl2 2.5, Hepes 10及glucose 5.6;用NaOH将pH值调成7.4。记录电极电阻2～5M?。所充电极内液成分为(mmol/L):KCl 120, HEPES 10, tripotassium citrate 10和EGTA 10;用KOH将pH值调成7.2。二、实验结果1.四组大鼠分别皮下给予生理盐水、孕酮(500μg)、RU38486(20μg)及孕酮(500μg)+RU38486(20μg)30min后用弗莱毛测大鼠后肢的疼痛反应,继续观察至60分钟,发现孕酮明显提高大鼠后肢外周机械痛阈,RU38486可以逆转孕酮这一作用。2. RT-PCR结果显示,大鼠DRG中孕酮的膜受体mPRα、mPRβ及mPRγmRNA均有表达,片段长度分别为:289, 379和440 bp。3.通过全细胞膜片钳的方法,发现在大鼠DRG神经元上孕酮(10 pm/L—1μm/L)对P2X3受体介导电流有快速抑制作用,且呈剂量依赖关系。孕酮受体阻断剂RU38486(1μm/L—100μm/L)可以逆转孕酮的这种抑制作用,提示孕酮的这一抑制作用有其受体参与。4.蛋白激酶阻断剂H-9(100μmol/L)可完全阻断孕酮的抑制作用。提示蛋白激酶参与了孕酮的抑制作用。5. PKA阻断剂KT5720(1μmol/L)可部分阻断孕酮的这种抑制作用。PKA激动剂forskolin(1μmol/L)可以模拟孕酮的这种抑制作用。这表明cAMP-PKA途径可能均参与了孕酮的抑制作用。6.PKC阻断剂G?6976(1μmol/L)、IP3阻断剂LY294,002(1μmol/L)及PLC阻断剂U73122(1μmol/L)时,均可部分阻断孕酮的这种抑制作用。同时,PKC激动剂PMA(1μmol/L)可以模拟孕酮的这种抑制作用。这表明PLC-IP3-PKC这一途径可能参与了孕酮的抑制作用。7.当同时给予PKA阻断剂KT5720(1μmol/L)和PKC阻断剂G?6976(1μmol/L)时,孕酮对P2X3电流的抑制作用完全被阻断,提示cAMP-PKA和PLC-PKC途径可能是孕酮调节P2X3受体功能的主要下游途径。三、结论1、孕酮可能通过作用于孕酮受体,快速抑制外周机械伤害性感受的形成。2、孕酮膜受体mPRα、mPRβ及mPRγ在DRG上均有表达,提示孕酮膜受体可能参与了外周痛觉转导。3、在分离培养的DRG细胞上,孕酮可以快速抑制P2X3受体介导的电流,这一作用可能通过孕酮的膜受体来完成。其作用机制可能涉及细胞内蛋白激酶PKC和PKA的改变,与cAMP-PKA途径和PLC-IP3-PKC途径有关。综上所述,孕酮对外周痛觉转导的调节可能是通过作用于膜受体,影响P2X3受体的功能来实现,且这一调节作用可能还包括细胞内cAMP-PKA途径和PLC-IP3-PKC途径的参与。这些结果不仅进一步证实了孕酮对于外周痛觉的形成具有抑制性调节作用,而且首次发现这一作用在外周痛信号的转导水平就已经存在。

全文目录

中文摘要  5-9
ABSTRACT  9-15
缩写词表  15-16
前言  16-19
材料与方法  19-29
  一、主要仪器与试剂  19-23
  二、实验方法  23-29
实验结果  29-52
  一、孕酮对大鼠外周痛阈的影响  29-30
  二、孕酮膜受体mRNA 在原代培养大鼠DRG 经元上的表达  30-31
  三、DRG神经元上ATP诱导电流  31-33
  四、孕酮对瞬时型电流的快速作用  33-38
  五、孕酮受体介导孕酮抑制P2X3受体介导电流  38-42
  六、孕酮抑制P2X3受体介导电流中的胞内机制  42-52
讨论  52-57
结论  57-58
文献综述  58-64
参考文献  64-71
在读期间发表文章  71-72
致谢  72

孕酮对P2X_3受体介导的外周痛觉信号转导的快速抑制作用

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