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两种环境内分泌干扰物对小鼠生精细胞T型Ca~(2+)通道的作用研究

作　者: 朱勤
导　师: 肖杭；高蓉
学　校: 南京医科大学
专　业: 卫生毒理学
关键词: 膜片钳小鼠生精细胞代森锰锌双酚A T型Ca2+通道
分类号: R114
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

精子与卵子的融合称受精,它是有性生殖的基本特征之一。精子在性腺中产生并发育至部分成熟,其在经过雌性生殖道后包裹在外的去能因子被清除,同时顶体膜结构中的蛋白质和膜电位发生变化,使精子获能而参与受精过程。获能的精子接触卵周的卵膜或透明带时,特异地与卵膜上的糖蛋白结合,激发精子产生顶体反应,使顶体外围的部分质膜消失,顶体外膜内陷、囊泡化,顶体内含物外逸,这有助于精子进一步穿越卵膜完成精卵结合。在众多研究表明离子通道与雄性哺乳动物生精及受精等生殖过程关系密切。其中T型Ca^<sup>2+通道在哺乳动物精子获能和顶体反应等功能中起重要作用。本文采用全细胞膜片钳技术记录并鉴定了小鼠生精细胞上的T型Ca^<sup>2+通道,并且进一步研究双酚A和代森锰锌对T型Ca^<sup>2+通道的作用。小鼠生精细胞Ca^<sup>2+电流呈现如下的特性:-60 mV时激活,-20 mV时达到最大值,翻转电位约为+40 mV;半数激活电压（V?1/2）为（-48.23±1.29）mV,激活斜率因子（K?）为（7.93±0.99）mV;半数失活电压（Vi1/2）为（-58.33±0.83）mV,失活斜率因子（K i）为（5.0±0.62）mV;峰电流时间常数tp和失活时间常数τh呈电压依赖性减小,常数改变e倍,电压分别改变11.02 mV、13.73 mV;通道去激活时间常数?d >1 ms,且呈电压依赖性增加;二价无机阳离子对Ca²⁺电流的抑制作用Ni²⁺+> Cd²⁺;通道Ba（2+）的选择性与Ca²⁺相似;以上特性都符合T型Ca²⁺通道的特征,证明我们在小鼠生精细胞上所记录到的电流为T型Ca²⁺电流。环境内分泌干扰物（EEDs）是一类可模拟天然激素生理、生化作用,干扰机体内自然激素的代谢过程,由此对生殖系统等造成可逆性或不可逆性的损害的物质。双酚A（BPA）和代森锰锌是近年来备受关注的环境内分泌干扰物。这些EEDs能模拟17β-雌二醇的作用或改变机体内分泌功能从而对机体和子代产生毒性作用。是生殖障碍、出生缺陷、发育异常等发病率不断上升的重要原因之一。双酚A（BPA）是一种类雌激素,其化学结构与雌激素结构类似。近年来的研究发现,BPA对男性生殖功能有显著影响。Vom Saal等的研究表明, BPA具有透过血睾屏障的能力并直接干扰精子的生长发育及活性。BPA能够影响精子细胞内外Ca²⁺浓度。但BPA对精子[Ca²⁺]i升高作用的机制至今还未阐明,是否通过T型钙通道起作用还不明确。我们利用全细胞膜片钳技术观察了BPA对小鼠生精细胞T型Ca²⁺通道的作用,进而推测BPA对哺乳动物精子生殖功能的作用机制。BPA（1,10、20、40）μmol·L^-1浓度依赖性地抑制小鼠生精细胞T型Ca²⁺电流,抑制率分别为（11.07±1.70）%、（37.10±2.43）%、（56.00±2.83）%、（69.92±3.98）% （n=6,P<0.05）,且BPA对T型Ca²⁺电流的抑制作用呈电压依赖性,随着电压升高抑制率增加。BPA对T型Ca²⁺通道的半数最大抑制浓度K50为13.06μmol·L-1。20μmol·L^-1处理之后,激活和失活曲线均显著向超极化方向移动;与之相应的,T型Ca²⁺通道电流密度显著降低,并且向超极化方向移动,峰电流电压同样左移;峰电流时间常数t_p、失活时间常数τ_h和去激活时间常数?d均减小;而复活时间常数r增大。研究表明,微量元素与性功能,性激素分泌,生殖系统的病变密切相关。代森锰锌是一种乙撑双二硫代氨基甲酸锰和锌离子的配位络合物,其作为一种广谱的保护性杀菌剂是制造复配型农药的重要原料。目前普遍认为代森锰锌能够抑制小鼠精子的运动,对雄性生殖系统有损害作用,但是其作用机制还不明确。我们运用全细胞膜片钳技术观察代森锰锌对小鼠生精细胞T型Ca²⁺通道的作用,从而推测代森锰锌对哺乳动物精子获能和顶体反应等生殖功能影响的可能机制。结果提示代森锰锌能够浓度依赖性的抑制小鼠生精细胞T型Ca²⁺通道,代森锰锌（10、20、40、80、120）μmol·L^-1对钳制电位为-90mV,刺激电压为-20mV时Ca²⁺电流的抑制率分别为（9.93±0.90）%、（20.93±2.50）%、（25.92±2.80）%、（42.64±3.10）%、（56.80±3.20）% （n=6,P<0.05）。且代森锰锌对T型Ca²⁺电流的抑制作用呈非电压依赖性,半数最大抑制浓度K₅0为36.50μmol·L^-1。120μmol·L^-1代森锰锌作用后,T型Ca²⁺通道的激活曲线和失活曲线均向超极化方向轻微移动;峰电流时间常数t_p、失活时间常数τ_h和去激活时间常数?d均减小;而复活时间常数?r增大。

全文目录

摘要  5-8
Abstract  8-12
引言  12-15
第一部分小鼠生精细胞T 型Ca~(2+)通道的研究进展  15-31
  第一节小鼠生精细胞的获得及鉴定  15-19
  第二节小鼠生精细胞T 型Ca~(2+)通道的记录及鉴定  19-31
第二部分双酚A 对小鼠生精细胞T 型Ca~(2+)通道的作用  31-41
  材料与方法  32-33
  结果  33-37
  讨论  37-41
第三部分代森锰锌对小鼠生精细胞T 型Ca~(2+)通道的作用  41-49
  材料与方法  42
  结果  42-45
  讨论  45-49
参考文献  49-58
综述1  58-71
  参考文献  65-71
综述2  71-86
  参考文献  83-86
综述3  86-100
  参考文献  97-100
致谢  100

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