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亚洲黑熊脑源性神经营养因子全长基因和活化素β_A亚基基因的克隆及分子进化分析

作　者: 张志敏
导　师: 刘中来
学　校: 华中师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 亚洲黑熊脑源性神经营养因子基因活化素β_A亚基基因分子进化非损伤性取样粪便DNA
分类号: Q951
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

亚洲黑熊(Selenarctos thibetanus)隶属食肉目熊科(Ursidae),主要分布于俄罗斯与亚洲的印度、尼泊尔、日本、朝鲜、阿富汗、巴基斯坦和中国。20世纪80年代,我国活熊取胆掀起的养熊热致使约9000多只野生黑熊被关进牢笼,由于饲养条件的限制,圈养黑熊只有野生黑熊寿命的1/3,这次熊类资源的浩劫导致黑熊数量骤减。我国的亚洲黑熊约有17500只。目前,亚洲黑熊已被国际濒危物种贸易公约列为一类保护动物,在我国也被列入濒危动物红皮书易危(Ⅴ)级,国家二级重点保护动物。亚洲黑熊具有很高经济价值,同时又是国宝大熊猫的近亲。由于取材困难等原因,目前国内对黑熊的研究主要集中在形态学、饲养繁殖和熊胆采集等方面;国外则侧重于传染病学、形态学、行为学、各类疾病和生长发育等方面;对染色体组型及遗传结构研究的报道很少,分子水平上的研究仅见于少数几个线粒体基因,未见核基因的报道。为满足我国人工养殖黑熊及其合理利用的需要,有必要从分子生物学水平收集亚洲黑熊种质资源方面的资料、探讨黑熊种属间的亲缘关系,为黑熊生态、遗传、繁殖与发育方面提供依据。沿用本室改进的粪便提取方法,参照马来熊BDNF基因序列设计引物,首次从亚洲黑熊粪便DNA中扩增和克隆到包含完整核BDNF基因的753bp片段,以毛发作阳性对照并进行重复实验,获得稳定一致结果。序列分析表明,亚洲黑熊的BDNF基因非常保守,与人相比,一致性达94.5%,与大熊猫比达98.9%。在推导的多肽序列中,其成熟区氨基酸序列与所有已报道哺乳动物的完全一致;对亚洲黑熊及其相关物种BDNF基因序列的比较分析,发现大熊猫与包括黑熊在内的熊科动物亲缘关系更近,而与小熊猫较远。本文首次采用非损伤性取样法在分子生物学水平对亚洲黑熊基因组核BPNF基因进行分析,不仅为亚洲黑熊的保护和繁育提供重要参考资料,为非损伤性取样在珍稀濒危野生动物研究中的应用拓宽了思路,也为亚洲黑熊及其近缘种的系统分类研究提供分子证据。借鉴互联网中已经克隆到的抑制素β_A亚基基因的序列,设计并合成一对兼并引物,首次扩增和克隆到亚洲黑熊的β_A亚基基因的357bp片段,以水作为阴性对照排

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-10
一、前言  10-24
  1. 亚洲黑熊的分子生物学研究进展  12-16
  2. 脑源性神经营养因子及其编码基因的特点和研究进展  16-17
  3. 抑制素/活化素B_A亚基编码基因的特点和研究进展  17-19
  4. 非损伤性取样法提取DNA的研究进展  19-22
    1.1 毛发的非损伤性取样分析  20
    1.2 粪便的非损伤性取样分析  20-22
    1.3 其它样品的非损伤性取样分析  22
  5. 本项目研究的内容与目的  22-24
二、材料与方法  24-32
  1. 实验材料  24-26
    1.1 实验动物材料  24
    1.2 主要试剂  24
    1.3 实验设备与仪器  24-25
    1.4 主要溶液  25-26
  2. 实验方法  26-32
    2.1 DNA的提取  26-28
    2.2 从粪便和毛发基因组DNA中扩增目的片段  28-29
    2.3 DNA扩增片段的纯化  29
    2.4 DNA扩增片段的克隆  29-32
三、实验结果  32-36
  1. 毛发和粪便基因组DNA的提取  32
  2. 亚洲黑熊BDNF基因的克隆与测序结果  32-34
    2.1 BDNF基因PCR扩增产物的电泳检测  32-33
    2.2 亚洲黑熊BDNF基因的核苷酸组成及推导的氨基酸序列  33-34
  3. 亚洲黑熊抑制素β_A亚基基因的克隆与测序结果  34-36
    3.1 抑制素β_A亚基基因PCR扩增产物的电泳检测  34
    3.2 亚洲黑熊抑制素β_A亚基基因的核苷酸组成及推导的氨基酸序列  34-36
四、讨论  36-43
  1. 亚洲黑熊BDNF基因序列和蛋白质序列分析及分子进化树的构建  36-38
  2. 亚洲黑熊抑制素β_A亚基基因序列和蛋白质序列分析及分子进化树的构建  38-41
  3. 粪便取样的可靠性和可行性  41-42
  4. 后续工作  42-43
参考文献  43-51
缩写词  51-52
在校期间发表的论文、科研成果等  52-53
致谢  53

亚洲黑熊脑源性神经营养因子全长基因和活化素β_A亚基基因的克隆及分子进化分析

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