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蔷薇科植物病毒研究

作　者: 王冲
导　师: 陈集双
学　校: 浙江大学
专　业: 微生物学
关键词: 蔷薇科 病毒检测 李属坏死环斑病毒 洋李矮缩病毒 苹果花叶病毒 苹果茎沟病毒 苹果褪绿叶斑驳病毒 玻片杂交检测 同源性分析 系统发生树
分类号: S432.41
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
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内容摘要


论文对浙江、山东、辽宁等地的蔷薇科主要经济植物上的主要病毒进行了检测和分子鉴定,比较了该科植物中的主要病毒李坏死环斑病毒(PNRSV)、苹果茎沟病毒(ASGV)、苹果花叶病毒(ApMV)和洋李矮缩病毒(PDV)分离物的序列同源性、血清型和种内进化关系,初步研究了应用玻片杂交技术来检测该科植物上以上病毒的发生概况。 田间症状调查显示,蔷薇科植物病毒病症复杂多样。ELSIA和RT-PCR检测表明,在我国甜樱桃上PNRSV的感染率很高,ELISA检测阳性率为45%;苹果褪绿叶班驳病毒(ACLSV)也可能是甜樱桃上的主要病毒,RT-PCR检测阳性率为30%。ASGV和ApMV是苹果上的主要病毒,ELISA检测阳性率分别为26.7%和18.3%。PNRSV在玫瑰、桃和苹果上偶有发生,侵染率不高。我们没有在中华樱桃上检测到PNRSV。组织病理学观察显示感病樱桃叶肉细胞组织病变严重,组织病变情况呈多样性,可以观察到线状病毒粒子群或结晶体。 通过RT-PCR方法获得8个PNRSV分离物(PNRSV-C4、PNRSV-CTA、PNRSV-C3、PNRSV-C915、PNRSV-A1、PNRSV-A2、PNRSV-P、PNRSV-R)的CP基因序列,PNRSV-P分离物CP基因核苷酸序列长度为675 bp,其它7个分离物CP基因核苷酸序列长度为681bp。所获得分离物与54个其它地区的分离物进行同源性分析、血清型分析和系统进化树分析。各分离物间的核苷酸序列同源性为87.7%-100%,氨基酸序列同源性为87.9-100%。杭州桃分离物PNRSV-P归属为亚组Ⅲ成员,其余七个分离物均为亚组Ⅰ成员。亚组Ⅰ与亚组Ⅱ、Ⅲ的最显著的区别是亚组Ⅰ在第118-125碱基之间插入了6个核苷酸长度的序列。核苷酸序列系统发生树分析表明不同地区、不同寄主来源的PNRSV分离物不表现明显的地域相关性或寄主相关性。CP蛋白氨基酸序列比较和抗原指标分析显示分离物PNRSV-P属于CH9血清型温和致病型的株系,其余7个分离物与CH9血清型皱缩致病型株系的抗原指标比较相似,但在第5、62和126位氨基酸处的抗原指标差别较大。 通过RT-PCR方法从苹果上获得2个ASGV分离物和一个ApMV分离物,分别命名为ASGV-A1、ASGV-A2和ApMV-A。对不同地区来源、不同寄主来源的12个ASGV分离物进行CP基因核苷酸和氨基酸序列进行同源性比较,核苷酸序列的同源性为90.2%-100%,氨基酸序列同源性为94.1%-100%。ASGV-A1和ASGV-A2与巴西的分离物UV01之间的核苷酸序列和氨基酸序列同源性最高,核苷酸序列同源性分别为分别为99.2%和99.6%,氨基酸同源性分别为99.6%和100%,应该是同一病

全文目录


摘要  10-12
ABSTRACT  12-14
第一章 前言  14-32
  1．1 蔷薇科经济植物  14-16
  1．2 蔷薇科植物的经济意义  16-17
  1．3 蔷薇科作物生产现状  17
  1．4 蔷薇科经济植物主要病毒的研究进展  17-26
    1．4．1 李属坏死环斑病毒  18-20
    1．4．2 苹果茎沟病毒  20-22
    1．4．3 苹果花叶病毒  22-23
    1．4．4 洋李矮缩病毒  23-24
    1．4．5 侵染蔷薇科木本植物的其它病毒  24-26
  1．5 植物病毒研究的方法学  26-31
    1．5．1 生物学方法  26-27
    1．5．2 电子显微镜技术  27
    1．5．3 血清学方法  27-28
    1．5．4 分子生物学方法  28-31
      1．5．4．1 病毒dsRNA分析  28-29
      1．5．4．2 PCR和RT-PCR技术  29
      1．5．4．3 核酸杂交方法  29-30
      1．5．4．4 基因芯片方法  30
      1．5．4．5 异源双链泳动分析法  30-31
  1．6 本研究的目的和意义  31-32
    1．6．1 研究内容  31
    1．6．2 预期目标  31-32
第二章 蔷薇科植物病毒的多样性研究  32-43
  2．1 材料与方法  32-35
    2．1．1 毒源采集与保存  32
    2．1．2 病毒双链RNA提取与病毒基因组分分析  32-33
    2．1．3 感病植物的组织病变观察  33-34
    2．1．4 ELISA实验步骤  34
    2．1．5 寄主反应测定  34
    2．1．6 总RNA提取  34-35
    2．1．7 RT-PCR检测  35
  2．2 结果与分析  35-42
    2．2．1 蔷薇科植物病毒病田间症状  35-36
    2．2．2 dsRNA分析结果  36-38
    2．2．3 ELISA检测结果  38-39
    2．2．4 寄主反应测定结果  39-40
    2．2．5 病变组织观察  40
    2．2．6 RT-PCR检测结果  40-42
  2．3 小结  42-43
第三章 李属坏死环斑病毒分子克隆与序列分析  43-63
  3．1 材料与方法  44-48
    3．1．1 病毒分离物  44
    3．1．2 酶与试剂  44
    3．1．3 引物设计  44
    3．1．4 病毒RNA模板的制备  44
    3．1．5 RT-PCR和cDNA合成  44-45
    3．1．6 PCR反应和目标片段的扩增  45
    3．1．7 PCR产物回收  45-46
    3．1．8 RNA玻片杂交  46
    3．1．9 DNA片段的连接  46-47
    3．1．10 感受态细胞的制备  47
    3．1．11 重组质粒的转化  47
    3．1．12 重组质粒DNA的制备(碱裂解法)  47-48
    3．1．13 重组质粒的鉴定  48
      3．1．13．1 重组质粒的酶切鉴定  48
      3．1．13．2 菌液PCR鉴定  48
    3．1．14 DNA测序和序列同源性比较  48
  3．2 结果分析  48-61
    3．2．1 PNRSV部分序列的cDNA的克隆  48-50
    3．2．2 不同PNRSV分离物的序列分析  50-51
    3．2．3 PNRSV分离物CP基因序列酶切位点分析  51
    3．2．4 不同PNRSV分离物CP核苷酸序列同源性比较  51-55
    3．2．5 不同PNRSV分离物CP氨基酸序列同源性比较  55-59
    3．2．6 PNRSV分离物序列末端分析  59-60
    3．2．7 玻片杂交结果  60-61
  3．3 小结  61-63
第四章 侵染苹果的两种病毒的分子鉴定与检测  63-81
  4．1 材料与方法  64-67
    4．1．1 病毒分离物  64
    4．1．2 酶与试剂  64
    4．1．3 引物设计  64-65
    4．1．4 总RNA模板的制备  65
    4．1．5 RT-PCR和cDNA合成  65-66
    4．1．6 PCR反应和目标片段的扩增  66-67
    4．1．7 PCR产物回收  67
    4．1．8 DNA片段的连接  67
    4．1．9 感受态细胞的制备  67
    4．1．10 重组质粒的转化  67
    4．1．11 重组质粒DNA的制备(碱裂解法)  67
    4．1．12 重组质粒的鉴定  67
      4．1．12．1 重组质粒的酶切鉴定  67
      4．1．12．2 菌液PCR鉴定  67
    4．1．13 DNA测序和序列同源性比较  67
    4．1．14 RNA玻片杂交  67
  4．2 结果分析  67-80
    4．2．1 ASGV和ASPV部分序列的cDNA的克隆  67-69
    4．2．2 ASGV和ApMV分离物的序列分析  69-70
    4．2．3 不同ASGV分离物CP核苷酸序列同源性比较  70-71
    4．2．4 不同ASGV分离物CP氨基酸序列同源性比较  71-73
    4．2．5 不同ApMV分离物CP核苷酸序列同源性比较  73-76
    4．2．6 不同ApMV分离物CP氨基酸序列同源性比较  76
    4．2．7 两种病毒的玻片杂交结果  76-80
  4．3 小结  80-81
第五章 侵染甜樱桃的洋李矮缩病毒  81-93
  5．1 材料与方法  81-84
    5．1．1 病毒分离物  81
    5．1．2 酶与试剂  81-82
    5．1．3 引物设计  82
    5．1．4 ELISA检测  82
    5．1．5 总RNA模板的制备  82
    5．1．6 RT-PCR和cDNA合成  82
    5．1．7 PCR反应和目标片段的扩增  82-83
    5．1．8 PCR产物回收  83
    5．1．9 DNA片段的连接  83
    5．1．10 感受态细胞的制备  83
    5．1．11 重组质粒的转化  83
    5．1．12 重组质粒 DNA的制备(碱裂解法)  83
    5．1．13 重组质粒的鉴定  83-84
      5．1．13．1 重组质粒的酶切鉴定  83-84
      5．1．13．2 菌液PCR鉴定  84
    5．1．14 DNA测序和序列同源性比较  84
  5．2 结果分析  84-92
    5．2．1 PDV序列的cDNA的克隆  84-85
    5．2．2 PDV分离物的序列分析  85-86
    5．2．3 不同PDV分离物CP核苷酸序列同源性比较  86-87
    5．2．4 不同PDV分离物CP氨基酸序列同源性比较  87-92
  5．3 小结  92-93
总讨论  93-96
参考文献  96-102
附件  102-104

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 植物病害及其防治 > 侵（传）染性病害 > 病毒
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