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云南温泉栖热菌热稳定性普鲁兰酶高产菌株筛选的初步研究

作　者: 刘涛
导　师: 陈朝银
学　校: 昆明理工大学
专　业: 生物化工
关键词: 云南热泉栖热菌普鲁兰酶
分类号: Q939.99
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
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内容摘要

栖热菌是地热高温菌的典型代表,是高温生物学基础性研究和应用性研究的重点菌群,与水热环境关系密切,呈世界性分布,除各地地热温泉外,人工水热环境如热水管道及自热的堆肥,海底火山门附近都曾分离到栖热菌株,栖热菌的应用开发也取得了很大的进展,最具代表性的就是产自栖热菌的Taq酶应用于PCR反应,带来分子生物学的巨大发展。云南水热活动区数量为全国第一,其中腾冲又居云南之首,而且它是中国大陆上唯一的火山地热区。全县有95个水热显示区,活动强度高,其中蕴含的微生物资源也非常丰富。普鲁兰酶(Pulullanase)是淀粉酶的一种,能专一性的水解曲霉多糖(Pullulan),淀粉,支链淀粉和相应的低聚糖中的α-1,6糖苷键的一种脱枝酶(Abdullab et al, 1960)。普鲁兰酶既能分解支链淀粉产生还原糖,也能水解普鲁兰多糖产生还原糖,在淀粉深加工、啤酒酿造等多种工业中具有广泛的应用。目前已经发现很多种微生物都能分解支链淀粉产生普鲁兰酶,如芽孢菌、产气气杆菌、放线菌、栖热菌等。工业应用的普鲁兰酶多是由芽孢菌等微生物产生的,目前世界上只有丹麦的NOVO公司得到的芽孢杆菌所产生的普鲁兰酶具有广泛的应用。栖热菌普鲁兰酶的研究只处于起步状态,只有国外少数科研机构进行过初步的研究,筛选得到的栖热菌菌株普鲁兰酶活力并不高,只有1u/ml左右,很难应用于工业生产。国内对普鲁兰酶的研究只局限于江南大学、兰州大学、中国科学院微生物研究所和江苏生物研究所等少数高校和科研单位,研究只局限于筛选高活力菌株,对所得到的菌株进行诱导、诱变,对发酵条件进行优化等方面。筛选得到的菌株只有芽孢菌,产气气杆菌等,到目前酶的活力还比较低,最高检测到的活力只有8.8u/ml,工业应用前景还很渺茫。本研究从云南高温热泉中筛选得到60株非芽孢菌菌株,对这些菌株产普鲁兰酶性状进行了筛选,分别检测了各菌株的α—淀粉酶、β—淀粉酶、异淀粉酶和普鲁兰酶活性,得到了一株普鲁兰酶初始酶活力比较高的菌株WQBGR2-3,初始酶活力达到0.069u/ml,该菌株WQBGR2-3为产红色色素、非芽孢的革兰氏阴性杆菌,该细菌在平板上能形成圆形、边缘平整、半透时,长杆状单一分布或者形成链状,无鞭毛,没有运动性。针对该菌株进行了生理生化实验,包括淀粉水解实验,过氧化氢酶实验等35个指标,根据对细菌WQBGR2-3的形态观察和生理生

全文目录

第一章引言  10-20
  1.1 栖热菌  10-13
    1.1.1 栖热菌种群的发现及鉴定  10-11
    1.1.2 栖热菌耐高温酶  11-13
  1.2 普鲁兰酶的种类及研究现状  13-20
    1.2.1 普鲁兰酶的种类  13-14
    1.2.2 微生物普鲁兰酶  14-16
    1.2.3 栖热菌普鲁兰酶  16-18
    1.2.4 异淀粉酶  18-20
第二章云南热泉栖热菌普鲁兰酶菌株筛选  20-44
  2.1 材料与方法  20-26
    2.1.1 材料与试剂  20-21
    2.1.2 实验仪器  21
    2.1.3 培养基  21-22
      2.1.3.1 环境样品分离培养基  21-22
      2.1.3.2 MD液体培养基  22
      2.1.3.3 保藏培养基  22
    2.1.4 菌种的分离和保藏方法  22
    2.1.5 产普鲁兰酶菌株初筛  22-23
    2.1.6 普鲁兰酶产生菌复筛  23-26
      2.1.6.1 普鲁兰酶检测  23-24
      2.1.6.2 α-淀粉酶检测  24-25
      2.1.6.3 β-淀粉酶检测  25-26
      2.1.6.4.异淀粉酶检测  26
  2.2 结果与讨论  26-42
    2.2.1 温泉样品中疑似菌株的分离纯化结果  26-30
    2.2.2 普鲁兰酶平板初筛结果  30-31
    2.2.3 普鲁兰酶复筛  31-42
      2.2.3.1 非芽孢菌普鲁兰酶活力检测  31-35
      2.2.3.2 疑似菌株普鲁兰酶活力检测结果分析  35-36
      2.2.3.3 疑似菌株其它淀粉酶活力检测  36-40
        2.2.3.3.1 α—淀粉酶检测及标准曲线  36-37
        2.2.3.3.2 β—淀粉酶检测及标准曲线  37-38
        2.2.3.2.3 异淀粉酶检测及标准曲线  38-40
      2.2.3.4 疑似菌株其它淀粉酶检测结果  40
      2.2.3.5 检测结果讨论  40-42
  2.3 小结  42-44
第三章云南热泉高温菌WQBGR2-3菌株高产热稳定性普鲁兰酶诱导及发酵条件优化  44-59
  3.1 前言  44
  3.2 材料与方法  44-46
    3.2.1 材料和仪器  44
    3.2.2 培养基  44-45
    3.2.3 实验方法  45-46
      3.2.3.1 WQBGR2-3普鲁兰酶诱导实验  45
      3.2.3.2 生长曲线与生长过程中普鲁兰酶的积累  45
      3.2.3.3 优化试验前的单因素实验  45
      3.2.3.4 二次正交组合响应表面实验设计  45-46
  3.3 结果与讨论  46-57
    3.3.1 诱导实验结果分析  46-47
    3.3.2 生长曲线及酶活力曲线测定结果  47-48
    3.3.3 优化实验的单因素实验结果  48-49
    3.3.4 二次三因素实验结果  49-55
    3.3.5 实验过程中其它问题分析  55-57
  3.4 小结  57-59
第四章云南热泉高温菌WQBGR2-3的普鲁兰酶分离纯化及酶学性质的初步研究  59-66
  4.1 材料与方法  59-60
    4.1.1 材料  59
      4.1.1.1 菌种  59
      4.1.1.2 试剂与仪器  59
    4.1.2 实验原理与方法  59-60
      4.1.2.1 丙酮沉淀  59-60
      4.1.2.2 鞣酸沉淀  60
      4.1.2.3 凝胶层析  60
      4.1.2.4 酶的pH、温度曲线及酶的热稳定性研究  60
  4.2 结果与讨论  60-65
    4.2.1 丙酮沉淀过程的监测及结果分析  61-62
    4.2.2 鞣酸沉淀结果分析  62
    4.2.3 凝胶层析分离蛋白质及结果分析  62-63
    4.2.4 酶的pH、温度曲线及热稳定性研究结果  63-65
  4.3 小结  65-66
第五章菌株WQBGR2-3的生理生化试验及初步鉴定  66-69
  5.1 所需仪器试剂  66
  5.2 实验方法  66-67
    5.2.1 菌落形态观察  66
    5.2.2 WQBGR2-3的生理生化实验  66-67
      5.2.2.1 过氧化氢酶实验  66-67
      5.2.2.2 动力实验  67
      5.2.2.3 淀粉水解实验  67
  5.3 结果与讨论  67-69
第六章结论  69-71
参考文献  71-76
致谢  76-77
附录及附表  77

云南温泉栖热菌热稳定性普鲁兰酶高产菌株筛选的初步研究

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