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农杆菌介导的紫花苜蓿BADH基因高效转化体系的优化和转基因植株的检测

作　者: 王国良
导　师: 李阳春；夏阳；梁慧敏
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 草业科学
关键词: 紫花苜蓿农杆菌介导的遗传体系的优化 BADH基因 PCR-Southern检测转基因植株抗盐浓度试验
分类号: S54
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

土壤盐渍化是一个世界性问题，是影响农业生产和生态环境的一个非常重要的非生物胁迫因素。如何利用大面积的盐碱地，提高作物耐盐性是生物科学的一个重要研究课题。苜蓿是一种被誉为“牧草之王”的多年生优质豆科牧草，它不仅营养价值高，适口性好，适应性强、抗寒耐旱，是全世界广为种植的优良牧草，而且对生态环境治理、固土护坡、防止水土流失起到非常重要的作用。如何进一步提高其耐盐抗旱特性，扩大其种植范围，是当前苜蓿生产面临的重要研究课题，基因工程的发展和应用为苜蓿抗盐育种开辟了一条新的途径。本实验是苜蓿抗盐碱育种研究课题的一部分，是在已建立的苜蓿高频组培再生体系的基础上，进行了农杆菌介导的甜菜碱醛脱氢酶基因转化的进一步研究。主要结果如下：1. 优化了农杆菌介导的苜蓿高效遗传转化体系。本试验在已有工作的基础上，对转化体系各因子进行了优化，确定了Cef最适浓度为400mg/L，Kan最适浓度为50mg/L；以GUS阳性发生率和抗性愈伤组织率为转化指标探讨了不同苜蓿基因型、不同外植体类型和外植体的不同生理状态对转化效率的影响，并选取转化效率高的基因型作为主要受体，侵染15天左右的叶片；在其它因子条件的优化中，适宜的菌液浓度OD600值为0.3-0.5，侵染时间15-20分钟，无预培养，共培养3-4天，在农杆菌液体培养基及共培养基中都加入乙酰丁香酮（10mg/L）的处理方式比较好，侵染效率比较高。2. 转化植株的PCR检测。转化研究中获得了大量Kan抗性愈伤组织，愈伤组织分化出再生植株后，提取其DNA进行PCR扩增反应，以PCR-Southern确定扩增出来的条带为特异性条带，在145个检测株系中，共获得34个呈阳性反应的株系。结果表明BADH基因已成功的转入苜蓿基因组中。3. 转基因植株的耐盐性试验。组培条件下的抗盐梯度实验表明：未转基因植株在盐浓度达到0.7%时就停止生长，超过0.9%植株大部分已白化死亡，而转基因植株在盐浓度0.7-0.9%时基本能正常生长，在1.2%盐害胁迫时出现明显受害症状，表现为植株停止生长和叶片白化。由此说明BADH基因在转化植株中得到了良好表达。

全文目录

主要英文缩略词表  5-6
摘要  6-7
Abstract  7-9
前言  9-10
第一章农杆菌介导的苜蓿甜菜碱醛脱氢酶基因转化体系的优化  10-28
  1 材料与方法  10-14
    1.1 材料  10-11
      1.1.1 植物材料  10
      1.1.2 农杆菌菌株  10
      1.1.3 抗生素  10-11
      1.1.4 农杆菌培养基  11
      1.1.5 GUS组织化学染色试剂  11
    1.2 方法  11-14
      1.2.1 选择培养中抗菌素及其浓度的确定  11-12
      1.2.2 抗菌素对苜蓿胚性愈伤组织诱导的影响  12
      1.2.3 选择培养中Kan选择压的确定  12
      1.2.4 农杆菌介导的遗化转化方法  12-13
      1.2.5 GUS组织化学染色分析  13
      1.2.6 转化效率评价指标  13
      1.2.7 转化体系的优化  13-14
  2 结果与分析  14-24
    2.1 选择培养中抗菌素及其浓度的确定  14-15
    2.2 抗菌素对胚性愈伤组织诱导的影响  15-16
    2.3 选择培养中选择压的确定  16-17
    2.4 转化体系的优化  17-24
      2.4.1 不同基因型对转化的影响  17
      2.4.2 不同外植体类型对转化效率的影响  17-18
      2.4.3 外植体生理状态对转化效率的影响  18
      2.4.4 农杆菌菌液浓度对转化效率的影响  18-19
      2.4.5 侵染方式对转化效率的影响  19-20
      2.4.6 侵染时间对转化效率的影响  20
      2.4.7 乙酰丁香酮(AS)对转化效率的影响  20-21
      2.4.8 不同pH值对转化效率的影响  21-22
      2.4.9 预培养时间对转化效率的影响  22-23
      2.4.10 共培养时间对转化效率的影响  23-24
    2.5 再生植株的获得  24
  3 讨论  24-27
    3.1 农杆菌介导的基因转化机理  24
    3.2 外植体对转化效率的影响  24-25
    3.3 农杆菌菌株对转化的影响  25-26
    3.4 共培养与预培养时间  26-27
    3.5 选择方法和选择时间对转化的影响  27
  4 结论  27-28
第二章转化植株的分子生物学检测  28-35
  1 材料与方法  28-32
    1.1 材料  28
    1.2 方法  28-32
      1.2.1 植物基因组DNA的提取  28-29
      1.2.2 农杆菌质粒DNA的提取  29-30
      1.2.3 PCR扩增及电泳检测  30-32
      1.2.4 PCR-Southern分子杂交  32
  2 结果与分析  32-33
    2.1 植物基因组DNA的提取效果  32-33
    2.2 农杆菌质粒DNA的提取效果  33
    2.3 PCR扩增结果  33
    2.4 PCR-Southern分子杂交检测结果  33
  3 讨论  33-34
    3.1 特定基因克隆鉴定的可靠性  33-34
    3.2 转化植株PCR扩增结果的说明  34
    3.3 基因在植株体内表达量的问题  34
  4 结论  34-35
第三章转基因苜蓿组培苗耐盐性鉴定  35-41
  1 材料与方法  35
    1.1 材料  35
    1.2 方法  35
      1.2.1 不同NaCl浓度对转基因苜蓿生长分化的影响  35
      1.2.2 不同NaCl浓度对转基因苜蓿根系发生的影响  35
  2 结果与分析  35-38
    2.1 不同盐份浓度对转基因苜蓿生长和分化的影响  35-37
      2.1.1 不同盐份浓度对转基因苜蓿始分化天数的影响  35-36
      2.1.2 不同盐份浓度对转基因苜蓿分化率的影响  36
      2.1.3 不同NaCl浓度对转基因苜蓿生长势的影响  36-37
    2.2 不同NaCl浓度对转基因苜蓿根系发生的影响  37-38
      2.2.1 不同盐份浓度对转基因苜蓿始生根天数的影响  37
      2.2.2 不同盐份浓度对转基因苜蓿生根率的影响  37-38
      2.2.3 抗盐生根培养50天后转基因植株与对照性状变化情况  38
  3 组培苗的移栽  38-39
  4 讨论  39-40
    4.1 外源基因的表达与沉默  39
    4.2 苜蓿的耐盐性研究  39-40
  5 结论  40-41
文献综述  41-51
  1 植物的耐盐性与植物耐盐基因工程  41-47
    1.1 植物与盐胁迫  41-42
    1.2 植物耐盐机理  42-45
      1.2.1 渗透调节  42-43
      1.2.2 拒盐机理  43
      1.2.3 盐的区隔化  43-44
      1.2.4 调控钾离子运输系统  44
      1.2.5 调控水通道蛋白  44
      1.2.6 改变光合作用途径  44-45
    1.3 甜菜碱与植物耐盐基因工程  45-47
      1.3.1 甜菜碱对盐胁迫下植物的保护作用  45
      1.3.2 甜菜碱的合成部位及途径  45
      1.3.3 甜菜碱植物基因工程  45-46
      1.3.4 外源基因整合的鉴定  46-47
  2 苜蓿基因工程  47-49
    2.1 常用的基因转化法  47-48
      2.1.1 PEG介导基因转化法  47
      2.1.2 硅碳纤维介导基因转化法  47
      2.1.3 基因枪转化法  47-48
      2.1.4 农杆菌转化法  48
    2.2 转化内容  48-49
      2.2.1 抗虫基因  48
      2.2.2 抗病毒基因  48
      2.2.3 抗除草剂基因  48-49
      2.2.4 抗逆基因  49
      2.2.5 改良品质基因  49
      2.2.6 其它  49
  3 小结  49-51
参考文献  51-58
致谢  58-60

农杆菌介导的紫花苜蓿BADH基因高效转化体系的优化和转基因植株的检测

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