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SacB基因在紫花苜蓿中的转化和植株再生的研究及PCR扩增条件的确立

作　者: 李云霞
导　师: 马晖玲
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 草业科学
关键词: 紫花苜蓿转化体系转化植株的再生褐化因素 PCR扩增条件
分类号: S541.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

本研究以三个苜蓿品种（和田苜蓿、甘农3号和陇东苜蓿）为受体材料,采用农杆菌介导法进行SacB基因在苜蓿中转化的研究,并探索了转化植株再生条件及其再生过程中的褐化因素,筛选出卡那霉素抗性植株。进一步对转化组织进行了PCR检测,优化了PCR检测条件,确立了适宜的PCR扩增条件。主要研究内容及结果如下:1.建立了苜蓿三个品种基因转化体系。以和田苜蓿、甘农3号和陇东苜蓿的下胚轴为外植体,以农杆菌介导法为转化方法,进行了SacB基因的转化。系统研究了Kan对苜蓿组织生长的影响、Kan筛选时期和筛选浓度、菌液浓度、侵染时间及预培养时间。结果表明:Kan对苜蓿种子萌发的影响不显著;愈伤分化阶段是最适宜的筛选阶段,和田苜蓿、甘农3号、陇东苜蓿的选择压分别为80mg/L、60mg/L、60mg/L。生根阶段,3个品种的Kan选择压分别为100mg/L、80mg/L、80mg/L。甘农3号、和田苜蓿、陇东苜蓿适宜的菌液的OD值分别为0.6、0.5和0.4。紫花苜蓿转化前不需要进行预培养,适宜的侵染时间为10min。2.分析探讨了转化组织在冬夏两季再生过程中出现的褐化现象,提出了相应的解决的办法。培养物的褐化程度具有季节性差异。2,4-D的最佳作用天数为15-20d,愈伤诱导、分化再生和生根阶段蔗糖的最佳浓度分别为30g/L、20g/L和10g/L。基因型影响培养物的褐化程度,褐化程度顺序为陇东苜蓿>和田苜蓿>甘农3号。培养温度冬季以恒温25℃为宜,夏季以白天23℃+黑夜21℃为宜。光照以3000Lux左右为宜。NAA的浓度在夏季应较冬季适当降低,IBA诱导生根适宜在冬季使用,生根率高,且褐化少。3.优化了PCR反应条件,对转化组织进行了PCR检测。对转化体进行PCR检测,结果表明:最佳引物为a组引物;最佳退火温度为52℃;25ul的反应体系中,dNTP、Mg²⁺、TaqDNA的最佳用量分别是2.0ul、2.5ul和0.4ul。在选取的50个抗性愈伤中,仅有1个愈伤为阳性愈伤,转化率为2%。

全文目录

摘要  3-4
ABSTRACT  4-10
引言  10-12
第一章文献综述  12-25
  1. 植物的抗旱耐盐研究和基因转化与检测的方法  12-19
    1.1 牧草盐碱地种植概况、耐盐性及抗旱耐盐研究进展  12-13
      1.1.1 国内外牧草盐碱地的种植和盐碱地改良概况  12
      1.1.2 植物的耐盐机制  12-13
    1.2 植物耐盐的相关基因  13-15
      1.2.1 渗透调节有关基因  13-14
      1.2.2 保护酶基因  14-15
      1.2.3 转录因子和传递信号基因  15
      1.2.4 细胞程序性死亡有关基因  15
    1.3 果聚糖的抗旱机制  15-16
      1.3.1 果聚糖与渗透调节  15-16
      1.3.2 果聚糖与膜  16
      1.3.3 逆境下的果聚糖酶  16
    1.4 植物基因转化与检测的常用方法  16-19
      1.4.1 植物基因转化的常用方法  16-18
      1.4.2 常用的转基因植物基因检测方法  18-19
  2. 苜蓿基因工程研究  19-25
    2.1 转基因苜蓿的应用前景  19-20
    2.2 紫花苜蓿应用转基因技术进行遗传改良研究现状  20-23
      2.2.1 抗病基因品种的选育  20
      2.2.2 苜蓿抗虫基因的遗传转化  20-21
      2.2.3 苜蓿抗除草剂基因的转化研究  21-22
      2.2.4 抗逆品种选育  22
      2.2.5 品质改良  22-23
    2.3 苜蓿遗传转化所面临的挑战和解决的对策  23-25
      2.3.1 基因沉默现象  23
      2.3.2 进展不平衡  23
      2.3.3 基因来源较窄  23-24
      2.3.4 性状联合改良研究薄弱  24
      2.3.5 潜在生态危害  24-25
第二章农杆菌介导的抗旱基因在紫花苜蓿中的转化及其转化植株的再生  25-47
  1 实验材料及方法  25-28
    1.1 材料  25
      1.1.1 植物材料  25
      1.1.2 植物激素  25
    1.2 实验方法  25-28
      1.2.1 外植体的选取  25
      1.2.2 农杆菌介导的抗旱基因的转化的程序  25-26
      1.2.3 除KAN 外造成转化组织褐化的影响因素分析  26-27
      1.2.4 KAN 筛选时期和选择压的确定  27
      1.2.5 菌液浓度的确定  27
      1.2.6 预培养时间对转化的影响  27-28
      1.2.7 不同侵染时间对转化的影响  28
  2. 结果与讨论  28-41
    2.1 除KAN 外造成转化组织褐化的影响因素分析  28-35
      2.1.1 在冬夏两季三个发育阶段培养物褐化程度比较  28
      2.1.2 非季节性因素分析  28-32
      2.1.3 季节性因素分析  32-35
    2.2 卡那霉素在苜蓿基因转化再生过程中筛选时期及浓度确定  35-38
      2.2.1 KAN 对种子萌发的影响  35-36
      2.2.2 KAN 对愈伤诱导的影响  36-37
      2.2.3 愈伤分化再生阶段KAN 选择压的确定  37
      2.2.4 生根阶段KAN 选择压的确定  37-38
    2.3 菌液浓度的确定  38-39
    2.4 预培养时间对转化的影响  39-40
    2.5 不同侵染时间对转化的影响  40-41
  3. 讨论  41-45
    3.1 影响苜蓿组培中培养物褐化的因素及减少褐化的措施  41-44
      3.1.1 影响苜蓿组培中培养物褐化的因素  41-43
      3.1.2 减少褐化的措施  43-44
    3.2 KAN 筛选时期和浓度的确定  44
    3.3 菌液浓度、预培养时间和侵染时间对转化的影响[]  44-45
  4. 小结  45-47
第三章转化组织PCR 检测及其PCR 扩增条件的优化  47-57
  1 材料  47-49
    1.1 植物材料  47
    1.2 质粒和农杆菌菌株  47
    1.3 培养基  47
    1.4 生化试剂  47-48
    1.5 农杆菌质粒DNA 提取试剂  48
    1.6 植物基因组DNA 的提取试剂  48
      1.6.1 愈伤组织DNA 提取试剂  48
      1.6.2 植株DNA 提取试剂  48
    1.7 PCR 反应试剂、药品及仪器  48-49
  2. 实验方法  49-52
    2.1 菌种保存与活化  49
      2.1.1 菌种保存  49
      2.1.2 工程菌的纯化  49
    2.2 DNA 的提取  49-51
      2.2.1 质粒DNA 提取操作步骤  49-50
      2.2.2 愈伤组织提取DNA 步骤  50
      2.2.3 转化植株叶片的DNA 提取步骤  50-51
    2.3 DNA 纯度检测  51
    2.4 引物的筛选  51
    2.5 退火温度的筛选  51
    2.6 PCR 反应体系的优化  51-52
    2.7 转化愈伤组织的PCR 检测  52
  3. 结果与分析  52-55
    3.1 引物的筛选  52-53
    3.2 退火温度的确定  53-54
    3.3 PCR 反应体系的优化  54
    3.4 转化愈伤组织的PCR 检测  54-55
  4. 讨论  55-56
  5. 小结  56-57
结论  57-58
致谢  58-59
附图  59-60
参考文献  60-65
作者简介  65-66
导师简介  66-67

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