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淡水白鲳细胞寒害致死机理初步研究

作　者: 郑春静
导　师: 张铭；李亚南
学　校: 浙江大学
专　业: 动物学
关键词: 淡水白鲳寒害低温处理钙离子浓度 SOD活性低温协迫细胞死亡率超氧阴离子温度下降细胞内
分类号: Q959.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2002年
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内容摘要

本研究利用已建立的淡水白鲳细胞系，从细胞生物学水平对非耐寒鱼类淡水白鲳细胞在低温下死亡的机理进行分析。样品处理方法：淡水白鲳细胞在37℃下培养作为参照组，对照组细胞从37℃转到10℃或3℃中培养，处理时间分别为3h、6h、12h、24h、48h、72h。淡水白鲳成体鱼在不同温度下培养6h，再进行解剖取不同组织提取测定。本研究采用的主要实验方法：通过荧光显微观察、电镜超微结构观察确定CBT（淡水白鲳臀鳍细胞）和CP（草鱼胚胎细胞）在低温处理后的显微与超微结构的变化。应用DNA电泳分析细胞DNA在低温处理后的断裂现象。用荧光探针PI（碘化丙碇）、Indo-1及Rhodamin123分别检测细胞在低温度处理后DNA含量、细胞内钙离子浓度和线粒体膜电位。NBT法测定细胞内超氧阴离子（O₂^-）；采用邻苯三酚自氧化的方法测定低温下CP、CBT细胞系SOD活性以及不同温度下淡水白鲳成体不同组织SOD活性。结果表明：（1）CBT在低温协迫下，细胞圆缩，细胞核变形，染色质浓缩且边位，细胞质空泡状；细胞死亡率随处理时间的增加而增加；细胞内钙离子浓度随处理时间延长而递增；线粒体膜电位差在低温处理早期急速上升，随后一直下降；细胞内超氧阴离子（O₂^-）在低温处理前期出现高峰，接着呈下降趋势；细胞内SOD活性在低温处理前期减弱，接着上升，然后持续下降。经低温处理的CBT细胞DNA电泳并未出现表征凋亡的“DNA Ladder”梯带。（2）CP细胞系在10℃低温下细胞死亡率与时间成正比，120d的细胞具典型的凋亡现象，即细胞核固缩、染色体边集在核膜内侧；细胞体积变小；琼脂糖凝胶电泳上显示特征性的“梯状”带。在低温3℃协迫下，CP细胞线粒体膜电位差呈下降趋势，钙离子浓度则呈上升态。（3）从所测的每尾鱼的各种组织细胞总的SOD活性可见：随着温度的升高，鱼整体的SOD水平也随着上升。成体淡水白鲳随着温度下降，不同组织的SOD活性变化略有不同，脑部SOD的活性随着养殖水温的下降先升高，而后下降。从整体鱼分析，SOD主要分布在脑、肝、肾、肌肉及鳃组织。（4）从实验中可见低温（门℃）使鱼体色变深，突然升温导致鱼体色变白，随着养殖时间延长， 3天后又恢复原来的体色。从解剖中看到，当温度下降到17℃时，淡水白娼的脑腔内脂类呈半流动状态，随着温度的下降滞流现象更为严重。结论：（）初步研究认为淡水白娼细胞在低温下的死亡可能属于非凋亡形式的程序性细胞死亡。（2）细胞凋亡是 CP细胞在 10 C保存时间过长导致细胞不能在正常生长温度下恢复生长的根本原因。（3）CBT和 CP低温致死机制有所不同。（4）随着温度的升高，鱼整体的 SOD水平也随着上升，表明淡水白娼新陈代谢水平随温度升高而提高，生命活动旺盛。低温协迫导致淡水白娼脑部缺氧，SOD 活性持续上升。

全文目录

序言  2-6
前言  6-12
  研究背景  6-9
  中英文摘要  9-12
1 材料与方法  12-20
  1．1 材料  12
    1．1．1 细胞系  12
    1．1．2 培养基和试剂  12
    1．1．3 主要仪器和用具  12
  1．2 方法  12-20
    1．2．1 冻存细胞恢复与传代培养  12-13
      1．2．1．1 主要试剂及配制  12-13
      1．2．1．2 操作步骤  13
    1．2．2 低温和镉离子（Cd~（2+））处理  13
    1．2．3 台盼蓝染色检测细胞膜完整性  13-14
    1．2．4 荧光染色观察细胞  14
      1．2．4．1 吖啶橙（AO）  14
      1．2．4．2 Hochest33258  14
      1．2．4．3 AO与Hochest33258  14
      1．2．4．4 PI与Hochest33258双染  14
    1．2．5 扫描电镜切片  14-15
      1．2．5．1 主要试剂配制  15
      1．2．5．2 电镜制片操作步骤  15
    1．2．6 流式细胞仪测定凋亡百分率  15
    1．2．7 DNA琼脂糖电泳  15-16
      1．2．7．1 DNA提取  15-16
      1．2．7．2 DNA琼脂糖凝胶电泳  16
    1．2．8 线粒体膜电位测定  16
    1．2．9 细胞内游离钙离子测定  16-17
    1．2．10 细胞内超氧阴离子（O_2~-）  17
    1．2．11 细胞内SOD活性测定  17-20
      1．2．11．1 淡水白鲳成体不同组织SOD活性  17-18
      1．2．11．2 培养细胞SOD活性测定  18-20
2 结果  20-34
  2．1 相差显微镜观察细胞生长情况  20
  2．2 台盼兰染色检测细胞活性  20-21
  2．3 荧光染色观察低温下细胞及其核的变化  21-22
  2．4 低温对细胞膜通透性的影响  22
  2．5 低温对细胞超微结构的影响  22-24
  2．6 低温对细胞死亡率的影响  24-26
  2．7 低温对细胞凋亡DNA ladder形成的影响  26
  2．8 低温对细胞线粒体膜电位的影响  26-27
  2．9 低温对细胞游离钙离子浓度变化的影响  27-29
  2．10 低温对CBT细胞内超氧阴离子（O_2~-）的影响  29-30
  2．11 低温对鱼组织及细胞系SOD活性的影响  30-33
    2．11．1 成体淡水白鲳不同组织SOD活性测定结果  30-31
    2．11．2 培养细胞SOD活性测定结果  31-33
  2．12 低温对淡水白鲳生活生长的影响  33-34
3 分析与讨论  34-41
  3．1 细胞凋亡与程序性死亡  34-35
  3．2 细胞凋亡与线粒体膜电位  35-36
  3．3 Ca2+在凋亡中的作用  36-37
  3．4 超氧阴离子（O_2~-）与SOD活性在细胞凋亡中的作用  37-38
  3．5 机体抗逆过程中SOD的作用  38-40
  3．6 低温对淡水白鲳生活生长的影响  40-41
参考文献  41-45
附件  45-62
  附1：综述：鱼类细胞培养及其应用  45-54
  附2：已发表的论文：线粒体在细胞凋亡中的作用  54-62
  附3：学习期间发表的论文摘录  62

淡水白鲳细胞寒害致死机理初步研究

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