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新型实时荧光PCR检测体系的研究和应用

作　者: 郭秋平
导　师: 李庆阁
学　校: 厦门大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 实时PCR 基因分型 荧光淬灭双链探针 分子信标
分类号: Q503
类　型: 硕士论文
年　份: 2001年
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内容摘要


实时PCR是近几年发展起来的新型核酸检测技术，在临床诊断中具有极大的应用价值。与常规PCR检测技术相比，实时PCR集扩增检测于一体，大大提高了核酸检测的自动化程度，有效地消除了PCR产物污染。尤其是，实时PCR具有卓越的定量能力，灵敏度高，线性范围宽，结合各类探针技术，更具有极高的特异性。 该论文涉及一种新的实时PCR方法的建立和应用，论文分为四部分： 1．孪生引物实时PCR检测方法的建立。提出一种新型的实时PCR检测技术——孪生引物实时PCR。孪生引物是根据荧光淬灭和碱基配对原理设计的两条互补的DNA双链结构，其中一条DNA链是作为PCR扩增引物，称之为正引物；另一条与正引物序列完全互补，称之为负引物。我们以检测人β-珠蛋白基因为模型，建立了标记型和非标记型孪生引物实时PCR方法，证明该方法能抑制非特异扩增和防止引物二聚体生成。 2．孪生引物实时PCR基因分型技术。设计两种分别带不同荧光标记的孪生引物，采用实时PCR同时检测野生型和突变型模板，首次实现了非探针式单碱基突变的实时PCR基因分型。该技术速度快，易于自动化，特别适合大量单碱基突变基因的筛查。 3．孪生引物实时PCR检测端粒酶活性。端粒酶催化生成的核酸产物由许多短的重复序列组成，用一般的PCR方法检测容易形成引物二聚体，由于引物二聚体与特异扩增产物的序列相同，无法用基于探针或荧光染料的实时PCR特异检测。我们利用标记型孪生引物特有的特异扩增能力，实现了端粒酶活性的实时PCR检测。 4．用荧光淬火双链探针研究核酸酶的活性。在孪生引物的基础上设计出荧光淬火双链探针，建立了研究DNase Ⅰ酶切活性的实时 示踪方法。 另外，利用双激光荧光毛细管电泳技术研究了分子信标在实时 PCR中的作用机理，据此提出了采用轻微不对称PCR扩增能获得更 高的检测灵敏度，并用实验加以证实。

全文目录


中文摘要  4-6
英文摘要  6-8
一 前言  8-14
二 材料与方法  14-31
  （一） 材料  14-17
    1、主要酶、荧光染料和化学试剂  14
    2、样品标本  14
    3、引物与探针合成  14
    4、常用溶液、培养基配置（均以双蒸水配置）  14-16
    5、主要仪器  16-17
  （二） 实验方法  17-31
    1． 孪生引物实时PCR方法的建立  17-20
    2． 孪生引物实时PCR基因分型技术  20-26
    3． 孪生引物实时PCR检测端粒酶活性  26-27
    4． 荧光-淬灭双链探针检测DNase Ⅰ活性  27-28
    5． 分子信标作用机理的研究  28-31
三 结果与讨论  31-63
  1． 孪生引物实时荧光PCR检测技术的研究  31-42
    1．1 孪生引物实时PCR检测技术的原理  31-34
    1．2 孪生引物实时PCR方法的建立  34-42
      1．2．1 孪生引物的杂交及其变温反应  35-36
      1．2．2 标记型孪生引物的实时PCR检测  36-37
      1．2．3 负引物的长度对孪生引物PCR扩增效率的影响  37-39
      1．2．4 非标记型的孪生引物实时PCR检测  39-42
  2． 孪生引物实时PCR基因分型技术  42-54
    引言  42-43
    2．1 突变型模板的合成和克隆  43-46
    2．2 孪生引物实时PCR基因分型  46-52
    2．3 孪生引物PCR产物的同步荧光扫描基因分型  52-54
  3． 孪生引物实时PCR检测端粒酶活性  54-58
    3．1 孪生引物实时PCR检测人胃癌细胞中端粒酶活性  56-58
  4． 用荧光淬灭标记双链探针检测DNase Ⅰ的酶切活性  58-63
    4．1 荧光淬灭双链探针法对DNase Ⅰ内切酶的活性检测  60-63
四 小结  63
五 展望  63-66
参考文献  66-71
附录部分 利用毛细管电泳技术研究分子信标在实时荧光PCR检测技术中的作用机制  71-78
  引言  71-73
  1．利用双激光荧光毛细管电泳对实时PCR产物的分析  73-78
参考文献  78-79
待发表论文  79-80
致谢  80

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中图分类: > 生物科学 > 生物化学 > 一般性问题 > 生物化学技术
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