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PDCD5、黄芪注射液与顺铂联合基因免疫化疗抗子宫内膜癌作用的体外研究

作　者: 徐倩
导　师: 张英姿
学　校: 滨州医学院
专　业: 妇产科学
关键词: 子宫内膜癌 黄芪注射液 PDCD5 顺铂
分类号: R737.33
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


目的研究凋亡基因PDCD5编码蛋白、生物免疫制剂黄芪注射液与常规化疗药物顺铂联合作用对人子宫内膜癌细胞株HEC-1-B的作用效果及作用机制,为临床应用提供实验支持。方法人子宫内膜癌细胞株HEC-1-B常规培养至对数生长期备用。实验分三部分:第一部分为黄芪注射液与顺铂联合作用实验(10%、20%、40%黄芪注射液组、5ug/ml顺铂组、10%、20%、40%黄芪注射液+5ug/ml顺铂组);第二部分为黄芪注射液与PDCD5蛋白联合作用实验(5ug/ml、10ug/ml、20ug/ml PDCD5蛋白组、30%黄芪注射液+5ug/ml、10ug/ml、20ug/ml PDCD5蛋白组);第三部分为顺铂与PDCD5蛋白联合作用实验(5ug/ml、10ug/ml、20ug/ml PDCD5蛋白+5ug/ml顺铂组)。具体实验方法:1.倒置相差显微镜观察各组药物作用不同时间后细胞形态学改变,透射电镜观察细胞超微结构变化;2.以四氮甲唑蓝(MTT)实验检测各组药物作用不同时间后细胞的增殖抑制率;3.EGFP-PI双染流式细胞仪检测细胞周期改变及凋亡率,倒置荧光显微镜观察凋亡细胞荧光染色;4. Hoechst33258荧光染色法观察各组药物作用不同时间后凋亡细胞的核变化;5、以PDCD5蛋白的单克隆抗体为工具,免疫荧光法检测PDCD5蛋白核转位现象。结果实验第一部分:1.倒置显微镜及透射电镜观察结果:黄芪注射液单独作用于HEC-1-B细胞48小时,细胞开始出现凋亡形态学改变,随着药物浓度增大及作用时间延长,细胞凋亡形态学改变更加明显。透射电镜下可见凋亡细胞明显的超微结构改变。黄芪注射液与顺铂联合应用组细胞形态学改变出现时间更早,细胞改变更明显。2.MTT结果显示:10%黄芪注射液单独作用于HEC-1-B细胞48小时细胞增殖抑制率为0.0376,10%黄芪注射液与顺铂联合作用48小时细胞增殖抑制率为:0.2565,随着黄芪注射液浓度的增加及作用时间延长,细胞抑制率提高,各组之间差异有统计学意义(P<0.05)。3.流式细胞术结果:黄芪注射液与顺铂作用于HEC-1-B细胞48小时开始出现早期细胞凋亡,之后随着药物浓度增加及作用时间延长,细胞凋亡率及晚期凋亡率增加。倒置荧光显微镜观察结果与流式细胞术结果相一致。4.Hoechst33258活细胞核染色结果:黄芪注射液组以及黄芪注射液与顺铂联合组细胞核内不同程度的出现细胞凋亡表现,这种变化的严重程度也随着黄芪注射液的浓度增大及作用时间延长而加剧。实验第二部分:1.倒置相差显微镜观察PDCD5蛋白单独作用于HEC-1-B细胞,细胞生长增殖正常,未见明显形态学改变。PDCD5蛋白与30%黄芪注射液联合应用于HEC-1-B细胞则可见比30%黄芪注射液单独应用更明显的细胞形态学改变,这种细胞形态学改变随着PDCD5蛋白浓度增加及作用时间延长而更明显。2.MTT结果显示:5ug/ml PDCD5蛋白单独作用于HEC-1-B细胞无明显抑制细胞增殖的作用;5ug/ml PDCD5蛋白与30%黄芪注射液联合作用48小时细胞增殖抑制率为:0.2364,比30%黄芪注射液单独作用于HEC-1-B细胞48小时抑制率增加0.0405;随着PDCD5蛋白浓度增加及作用时间延长,细胞增殖抑制率增加,各组之间比较差异有统计学意义(P<0.05)。3.Hoechst33258染色后,PDCD5蛋白单独作用组和阴性对照组细胞无凋亡表现,PDCD5蛋白与30%黄芪注射液联合组细胞核则出现凋亡改变,随着PDCD5蛋白浓度增加及作用时间延长,细胞凋亡表现越明显。4.FITC-PDCD5单抗免疫荧光结果显示,PDCD5蛋白加入细胞培养液24小时,蛋白大部分被转移进入细胞核内,排列在细胞核周围,少部分位于核周胞质中。顺铂组、黄芪注射液组HEC-1-B细胞内出现内源性PDCD5蛋白表达,主要定位于细胞核。实验第三部分:1.倒置相差显微镜观察PDCD5蛋白与顺铂联合应用于HEC-1-B细胞可见比顺铂单独应用更明显的细胞形态学改变,这种细胞形态学改变随着PDCD5蛋白浓度增加及作用时间延长而更明显。2.MTT结果显示:5ug/ml PDCD5蛋白与5ug/ml顺铂联合作用48小时细胞增殖抑制率为:0.3176,比5ug/ml顺铂单独作用于HEC-1-B细胞48小时抑制率增加0.0529;随着PDCD5蛋白浓度增加及作用时间延长,细胞增殖抑制率增加,各组之间比较差异有统计学意义(P<0.05)。3.Hoechst33258荧光染色后,PDCD5蛋白与5ug/ml顺铂联合组细胞核内则出现颗粒块状蓝色荧光及胞核形态改变,随着PDCD5蛋白浓度增加及作用时间延长,细胞凋亡表现越明显。结论1.黄芪注射液对人子宫内膜癌细胞株HEC-1-B细胞有抑制增殖和促凋亡作用,这种作用呈时间、浓度依赖关系。2.黄芪注射液与顺铂联合使用对人子宫内膜癌细胞株HEC-1-B细胞的增殖抑制作用强于两种药物单独使用,二者具有协同抗肿瘤作用。3.PDCD5蛋白单独应用无抗肿瘤作用,但增强黄芪注射液对人子宫内膜癌细胞株HEC-1-B细胞的增殖抑制和促凋亡作用,这种作用具有PDCD5蛋白浓度、作用时间依赖关系。4.PDCD5蛋白对顺铂的抗肿瘤作用具有增敏作用,这种作用具有PDCD5蛋白浓度、作用时间依赖关系。5.PDCD5通过核转位方式发挥促进细胞凋亡作用。

全文目录


中文摘要  5-8
ABSTRACT  8-12
英文缩略词  12-13
引言  13-16
材料与方法  16-25
结果  25-34
讨论  34-43
结论  43-44
参考文献  44-48
附图  48-66
在学期间科研成绩  66-67
致谢  67-68
综述  68-74
  参考文献  72-74
论著  74-78
  参考文献  78

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