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MICA-NKG2D通路介导对口腔鳞癌免疫杀伤效应的实验研究

作　者: 李超
导　师: 蒋灿华
学　校: 中南大学
专　业: 口腔临床医学
关键词: 口腔 鳞状细胞癌 MHC-Ⅰ类链相关基因A 自然杀伤细胞2族成员D 免疫逃逸
分类号: R739.8
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


口腔鳞状细胞癌是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤,严重危害人类健康。已有研究表明,口腔鳞癌患者免疫功能低下,且与病变的发展和预后密切相关,因此通过免疫治疗来提高患者生存率已成为目前的一个研究热点。目的：探讨MICA-NKG2D信号通路关键分子在口腔鳞癌发生发展过程中的表达及其临床意义。建立MICA稳定过表达的口腔鳞癌细胞系,通过体内外实验研究MICA过表达对NK及CTL细胞NKG2D的表达及细胞毒作用的影响,以期为利用MICA-NKG2D信号通路作为口腔鳞癌的免疫治疗靶标提供实验依据。方法：1.实时定量PCR和免疫组织化学技术检测口腔鳞癌组织标本mMICA mRNA及蛋白的表达,ELISA与流式细胞术检测口腔鳞癌患者血清中sMICA及外周血PBMC中NKG2D的表达,采用SPSS16.0软件统计,分析其与口腔鳞癌患者临床病理参数的关系。2.PCR技术扩增pCMV-SPORT6-MICA中编码MICA基因全长的cDNA序列,重组至有绿色荧光蛋白标记的真核表达载体pEGFP-N1,构建最终表达载体pEGFP-N1-MICA,脂质体法转染Tca8113-Tb细胞,G418筛选,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,有限稀释法建立稳定过表达MICA基因的Tca8113-Tb细胞系,RT-PCR、real time PCR和免疫细胞化学技术验证MICA在该细胞中的表达情况。3.通过绘制细胞生长曲线、检测细胞周期、平板集落形成及裸鼠皮下成瘤等方法对稳定转染并过表达MICA的Tca8113-Tb细胞系进行生物学特性鉴定。乳酸脱氢酶释放法及流式细胞术分析Tca8113-Tb过表达MICA对NK与CTL细胞杀伤活性及NKG2D表达的影响。结果：1.免疫组织化学结果提示MICA分子定位于细胞胞浆与胞膜,表达强度癌旁组织高于口腔鳞癌(P<0.05),但癌旁组织与正常口腔粘膜以及正常口腔粘膜与鳞癌之间,差异无统计学意义(P>0.05),口腔鳞癌不同临床病理参数组间的比较,差异亦无统计学意义(P>0.05)。RT-PCR及real time PCR结果提示口腔鳞癌MICA mRNA表达的相对含量显著高于癌旁组织(P<0.05),且与临床分期、颈部淋巴结是否转移相关(P<0.05)。口腔鳞癌组织MICA mRNA与蛋白的表达无相关性(P>0.05)。2.78例口腔鳞癌患者血清sMICA检测阳性率98.7%(77/78),其含量的95%可信区间为74.30～93.95pg/mL,中位数为82.17pg/mL;19例健康成年人血清sMICA检测阳性率94.7%(18/19),其含量的95%可信区间为29.48～50.30pg/mL,中位数为37.54pg/mL,口腔鳞癌患者血清sMICA含量显著高于健康成年人(P<0.01),且不同肿瘤大小、临床分期及颈部淋巴结是否转移的组间比较,差异具有统计学意义(P<0.05),而不同性别、年龄及肿瘤分化程度的组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。3.56例口腔鳞癌患者PBMC表面NKG2D表达的阳性率为(12.49±5.26)%,显著低于正常健康成人(22.93±8.14)%(P<0.05)。口腔鳞癌患者PBMC表面NKG2D表达的阳性率在不同肿瘤大小和临床分期组间比较,差异具有统计学意义(P<0.05),而不同性别、年龄、肿瘤部位、病理分化程度及颈部淋巴结是否转移的组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。4.通过PCR技术获取了MICA基因全长并成功克隆入载体,测序鉴定该序列与GenBank中的序列相同。转染后细胞可见绿色荧光蛋白表达,RT-PCR、real time PCR及免疫细胞化学检测到目的基因MICA在转染细胞中过表达。5.口腔鳞癌细胞转染并过表达MICA基因后生长曲线、细胞周期、平板集落形成及裸鼠皮下成瘤等主要生物学特性未发生改变,但能显著增强NK与CTL细胞杀伤活性并上调其表面NKG2D的表达,与未转染及转染空白载体的细胞比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论：MICA-NKG2D信号通路中的关键分子与口腔鳞癌的发生发展密切相关。口腔鳞癌细胞过表达MICA后能上调NK及CTL细胞NKG2D的表达并增强其杀伤活性,MICA-NKG2D通路有望作为口腔鳞癌免疫基因治疗的潜在靶标。

全文目录


摘要  5-8
ABSTRACT  8-13
缩略词简表  13-15
前言  15-18
第一章 MICA-NKG2D信号通路关键分子在口腔鳞癌发生发展过程中的表达及临床意义  18-37
  第一节 MICA在口腔鳞癌组织中的表达及临床意义  18-27
    1.1. 材料  18-19
    1.2. 方法  19-23
    1.3 结果  23-26
    1.4 讨论  26-27
  第二节 口腔鳞癌患者血清sMICA的检测及临床意义  27-32
    2.1. 材料  27-28
    2.2. 方法  28-29
    2.3 结果  29-31
    2.4 讨论  31-32
  第三节 口腔鳞癌患者PBMC表面NKG2D的表达及临床意义  32-37
    3.1. 材料  32-33
    3.2. 方法  33-34
    3.3 结果  34-35
    3.4 讨论  35-37
第二章 稳定转染并过表达MICA基因口腔鳞癌细胞株的建立与鉴定  37-55
  第一节 MICA真核表达载体的构建与稳定转染细胞株的建立  37-47
    1.1. 材料  37-39
    1.2 方法  39-44
    1.3 结果  44-47
    1.4 讨论  47
  第二节 稳定转染MICA基因口腔鳞癌细胞株的生物学特性及对NK与CTL细胞杀伤活性影响的实验研究  47-55
    2.1 材料  48-49
    2.2 方法  49-52
    2.3 结果  52-54
    2.4 讨论  54-55
结论  55-56
参考文献  56-60
综述  60-67
  参考文献  65-67
致谢  67-68
在读期间主要研究成果  68-69

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 口腔、颌面部肿瘤
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