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半滑舌鳎等九种海水鱼微卫星分子标记的开发和应用

作　者: 徐亘博
导　师: 陈松林
学　校: 中国海洋大学
专　业: 遗传学
关键词: 海水鱼类分子标记微卫星遗传结构半滑舌鳎
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

渤海是黄海乃至整个北方海洋渔业资源的源头。面积约7.8万平方公里的渤海,是黄海、渤海乃至东海多种经济鱼虾类的主要产卵场、育幼场和索饵场,黄、渤海有鱼类300余种。历史上,渤海最高年捕捞量约占全国捕捞总量的十分之一。渤海渔业对全国海洋渔业的发展意义重大。但是,自上世纪80年代以来,由于长期的酷渔滥捕和水域污染、涉海工程建设等人为因素的共同影响,渤海渔业资源严重衰退,生态结构遭到严重破坏,生物多样性明显下降,种类组成趋于小型化、低质化,资源生产功能严重退化。为了更好地保护和合理利用渤黄海渔业资源,采用不同分子标记对一些具有重要经济价值或生态学意义的鱼类进行群体遗传分析,是鱼类生态学、水产资源学以及鱼类遗传与育种学不可缺少的应用基础性的研究工作。本研究主要包括三部分内容：第一部分是基于磁珠富集的方法,构建了半滑舌鳎、牙鲆、绿鳍马面鲀、蓝点马鲛、小黄鱼、鱵鱼、黑鲷7种海水鱼部分基因组DNA微卫星富集文库。通过筛选测序分别获得131、202、121、33、23、60、35条含有微卫星的序列,其中完美型、非完美型、混合型所占的平均比例分别为76.80%、13.66%和9.54%。文章中优化的FIASCO法由于自身的高效低耗等优点成为从海水鱼类中大量筛选微卫星标记的最好选择。第二部分是根据构建的富集文库中以及GENBANK数据库中的微卫星序列设计微卫星引物,对绿鳍马面鲀、皮氏叫姑鱼、梭鱼3种鱼类的自然捕捞群体进行了遗传结构的分析,利用至少21个体对其中162个位点进行多态性评价,结果显示扩增得到的等位基因数目从2到18个不等,期望杂合度(He)和观测杂合度(Ho)的范围分别为0.1463到0.9449和0.1562到1.0000,平均值分别为0.6437和0.5774。其中皮氏叫姑鱼微卫星位点的平均期望杂合度最高为0.8052,说明其有较高的杂合性。第三部分内容是半滑舌鳎微卫星标记在遗传图谱构建、雌雄群体与人工诱导雌核发育后代基因型分析中的应用：1.为初步构建半滑舌鳎遗传图谱,以全同胞家系产生的84个F1子代为作图群体,对306对SSR引物进行多态筛,共获得在双亲与后代中分离的多态微卫星标记表记100个,可用于遗传连锁分析。但若需进行主基因和QTL的分析以及真正实现分子标记辅助选择育种,还需获得更多多态分离标记以及开发新型SNP标记,以提高图谱中标记的覆盖水平；2.用8对半滑舌鳎微卫星标记对来自同一母本半滑舌鳎减数雌核发育鱼苗24尾进行了分析。其中4个座位全部为杂合。杂合比例最低的座位是Newcyse105,为0.5833。8个座位的平均杂合子比例为0.8665。结果显示通过抑制第二极体排出获得的半滑舌鳎雌核发育群体在个体和群体水平尚具有一定的基因杂合；3.用25对多态微卫星标记对半滑舌鳎雌、雄群体进行遗传分析,其中引物CSf1检出了雌性后代特有DNA片段。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-14
第一章文献综述  14-34
  1 常用DNA分子标记概述  14-21
    1.1 限制性内切酶片段长度多态性标记  16-17
    1.2 随机扩增多态DNA  17-18
    1.3 扩增片段长度多态性  18-19
    1.4 简单序列重复  19
    1.5 线粒体DNA标记  19-20
    1.6 单链构像多态性  20
    1.7 单核苷酸多态  20-21
  2 微卫星分子标记及其在鱼类遗传学中的应用  21-34
    2.1 微卫星分子标记的起源、分类及结构特点  21-23
    2.2 微卫星的多态性及其产生机制  23-25
    2.3 微卫星标记的优缺点  25-27
      2.3.1 微卫星标记的优点  25-26
      2.3.2 微卫星标记存在的问题  26-27
    2.4 微卫星标记的获得方法  27-30
      2.4.1 构建小插入片段基因组文库筛选微卫星DNA  27-28
      2.4.2 通过含有重复序列的AFLP的快速分离法  28-29
      2.4.3 公共核酸序列数据库检索  29-30
      2.4.4 同源转移法  30
    2.5 微卫星分子标记在鱼类遗传学中的应用  30-34
      2.5.1 进行种群遗传多样性分析  30-31
      2.5.2 分析群体遗传结构  31
      2.5.3 个体识别和亲自鉴定  31-32
      2.5.4 遗传连锁图谱的构建和标记辅助育种  32-34
第二章七种海水鱼部分基因组DNA微卫星富集文库的构建  34-50
  1 引言  34-37
  2 实验材料  37-38
    2.1 实验鱼  37
    2.2 实验仪器设备  37
    2.3 实验试剂  37-38
  3 实验方法  38-42
    3.1 基因组DNA提取  38-39
    3.2 限制性内切酶酶切  39
    3.3 双链接头的制备  39-40
    3.4 双链接头与DNA酶切片段连接及检测  40-41
    3.5 含有微卫星DNA片段的富集  41
    3.6 目的片段的扩增和TA克隆  41-42
    3.7 微卫星DNA序列筛查  42
  4 实验结果  42-47
    4.1 基因组DNA提取结果  42-43
    4.2 基因组DNA酶切结果  43
    4.3 双链接头连接后的PCR扩增结果  43-44
    4.4 磁珠杂交后目的洗脱片段的扩增结果  44
    4.5 微卫星阳性克隆的筛选结果  44-45
    4.6 测序结果与序列分析  45-47
  5 讨论  47-50
    5.1 构建文库基因组DNA的质量  47
    5.2 限制性内切酶的选择  47-48
    5.3 生物素微卫星探针的选择  48-49
    5.4 TA克隆前PCR反应条件的优化  49
    5.5 小结  49-50
第三章绿鳍马面触、皮氏叫姑鱼和梭鱼微卫星多态性检测  50-64
  1 引言  50-51
  2 实验材料  51
    2.1 实验鱼  51
    2.2 实验仪器及试剂  51
  3 实验方法  51-54
    3.1 基因组DNA提取  51
    3.2 微卫星PCR引物获得  51
    3.3 多态微卫星引物的初筛  51-52
    3.4 PCR产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳  52-53
      3.4.1 变性聚丙烯酰胺凝胶的制备方法  52
      3.4.2 电泳  52
      3.4.3 硝酸银染色  52-53
    3.5 三个群体的PCR扩增与多态位点确定  53
    3.6 统计与数据分析 #40·  53-54
  4 实验结果  54-61
    4.1 引物初筛结果  54-55
    4.2 三个群体的PCR扩增结果  55-56
    4.3 三个群体的遗传多样性分析  56-61
      4.3.1 绿鳍马面魨群体的遗传多样性分析结果  56-58
      4.3.2 皮氏叫姑鱼群体的遗传多样性分析结果  58-60
      4.3.3 梭鱼群体的遗传多样性分析结果  60-61
  5 讨论  61-64
    5.1 实验方法分析  61-62
    5.2 种群遗传多样性分析  62-63
    5.3 小结  63-64
第四章半滑舌鳎连锁图谱微卫星分离标记的获得  64-74
  1 实验材料  64
  2 实验方法  64-65
    2.1 作图策略  64
    2.2 微卫星标记的来源  64
    2.3 DNA提取、PCR反应和PAGE电泳检测  64-65
    2.4 分离标记数据统计  65
  3 实验结果  65-72
  4 讨论  72-74
第五章半滑舌鳎人工诱导减数雌核发育后代的SSR分析  74-80
  1 实验材料  74
  2 实验方法  74-75
    2.1 基因组DNA提取  74
    2.2 PCR反应和PAGE电泳检测  74
    2.3 统计分析方法  74-75
  3 实验结果  75-78
  4 讨论  78-80
第六章半滑舌鳎雌雄群体遗传差异分析的SSR初探  80-87
  1 实验材料  80
  2 实验方法  80
    2.1 微卫星标记的来源  80
    2.2 DNA提取、PCR反应和PAGE电泳检测  80
    2.3 数据统计  80
  3 实验结果  80-84
    3.1 雌雄群体遗传差异分析  80-83
    3.2 性别特异微卫星标记筛选结果  83-84
  4 讨论  84-87
结论  87-88
参考文献  88-102
致谢  102-103
个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果  103-105

半滑舌鳎等九种海水鱼微卫星分子标记的开发和应用

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