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β-葡萄糖苷酶生产菌的选育及其对葡萄酒中结合态香气的影响

作　者: 郭慧女
导　师: 喻晓蔚
学　校: 江南大学
专　业: 微生物学
关键词: β-葡萄糖苷酶玫瑰香葡萄结合态香气黑曲霉离子束诱变
分类号: TS262.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

β-葡萄糖苷酶是风味修饰中的关键酶,对葡萄酒香气的提升具有十分重要的作用,可用于饮料及食品工业中。国内的β-葡萄糖苷酶全都依赖于国外酶制剂公司,其价格昂贵,不适于工业化生产,国内还尚未出现适合的产品,而国内对于酶解葡萄结合态香气成分的研究也尚属空白。因此,需要研究具有自主知识产权并对葡萄酒香气物质起着重要作用的β-葡萄糖苷酶。从自然界中直接筛选在葡萄酒酿造环境中仍有高效酶活力的p-葡萄糖苷酶的菌株,成为得到高产β-葡萄糖苷酶菌株的最直接的方法。它可以改善葡萄酒的风味,又能节省购买酶的成本。1.本论文创新运用了一种快速、高效的筛选β-葡萄糖苷酶产生菌的方法—以p-NPG为底物的96孔板显色法,利用这种方法,从葡萄园的土壤及葡萄表皮中筛选得到了若干株具有β-葡萄糖苷酶活力的菌株。通过酶活比较得出其中三株菌酶活较高,将该三株菌加入到葡萄结合态香气中反应,其中一株效果最好且酶活最高,本论文对该菌株进行了研究。通过形态观察和18S rDNA序列分析,将该菌株鉴定为Aspergillus niger(黑曲霉)。2.本论文首先通过测定酶活力的高低,自行筛选出了三株产β-葡萄糖苷酶的菌株并将其应用于玫瑰香葡萄的结合态,结合固相微萃取、气质联用等技术,经β-葡萄糖苷酶作用发生水解断裂产生典型的萜烯、醇类、酯类等化合物,释放出令人愉快的香气物质。其中黑曲霉作用产生的香气物质含量远高于其他两种菌株,其中萜烯类香气物质最为丰富,占总香气含量的85.91%。说明β-葡萄糖苷酶对于增加葡萄结合态香气物质具有显著的作用。此类萜烯类化合物可以赋予葡萄酒特有的果香,而该差异性为实现葡萄酒香气的定向修饰特征提供了依据。3.为了更好的工业化生产,本论文利用合肥中科院的离子注入机对该菌株进行离子束诱变实验以提高其酶活。并对发酵培养基和发酵条件进行了优化,得到了最佳培养基培养条件,即麸皮4%,(NH4)2SO40.2%,尿素0.2%,KH2P04 O.1%,MgS04·7H2O0.04%,CaCl20.04%,接种量4%。最佳培养条件为：装液量为20 mL(250 mL瓶)；培养温度为30℃；摇床转速为180 r/min。经离子束诱变改造以及培养基条件的优化后该菌株产酶能力得到了较大的提高,比优化前提高了2.26倍,在发酵第7d时达到27.63 IU/mL。这与现在研究报道出的细菌、酵母以及其它菌株的β-葡萄糖苷酶酶活相比都有明显的优势。4.为了更好的考察该酶是否适用于葡萄酒酿造,论文通过硫酸铵盐析、离子交换层析、凝胶过滤层析对该菌株所产生的β-葡萄糖苷酶进行分离纯化并对其酶学性质进行了研究,该酶分子量为116 kDa左右,最适温度为50℃,最适pH值为5.0,对酒精有一定的耐受性,其中Cu2+对该酶有明显的抑制作用。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-8
第一章绪论  8-16
  1.1 葡萄酒香气  8
  1.2 β-葡萄糖苷酶研究概况  8-12
    1.2.1 β-葡萄糖苷酶的作用机理  8-9
    1.2.2 β-葡萄糖苷酶的来源  9-10
    1.2.3 β-葡萄糖苷酶的酶学性质  10
    1.2.4 β-葡萄糖苷酶的分离纯化  10-11
    1.2.5 β-葡萄糖苷酶对葡萄酒香气的影响  11-12
  1.3 β-葡萄糖苷酶的微生物筛选  12
  1.4 β-葡萄糖苷酶生产菌的选育  12-14
    1.4.1 离子注入的特点  12-13
    1.4.2 离子注入的生物效应  13
    1.4.3 离子束注入在微生物诱变育种的应用  13-14
  1.5 本论文研究的意义和内容  14-16
    1.5.1 论文研究的目的和意义  14
    1.5.2 研究内容  14-15
    1.5.3 技术路线  15-16
第二章材料和方法  16-22
  2.1 实验材料  16-17
    2.1.1 主要仪器  16
    2.1.2 主要试剂  16-17
    2.1.3 样品采集  17
    2.1.4 培养基  17
    2.1.5 配制试剂  17
  2.2 实验方法  17-22
    2.2.1 产β-葡萄糖苷酶菌株的筛选  17-18
    2.2.2 酶活的测定  18
    2.2.3 菌株的分类鉴定  18-19
    2.2.4 对筛选出的菌株的离子束诱变  19
    2.2.5 葡萄结合态香气的萃取  19
    2.2.6 酶促水解  19
    2.2.7 HS-SPME条件  19-20
    2.2.8 GC-MS分析  20
    2.2.9 定性和半定量分析  20
    2.2.10 蛋白质含量测定  20
    2.2.11 液态发酵产β-葡萄糖苷酶的纯化  20-21
    2.2.12 β-葡萄糖苷酶的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析  21
    2.2.13 β-葡萄糖苷酶的酶学性质研究  21-22
第三章结果与讨论  22-41
  3.1 产β-葡萄糖苷酶菌株的分离筛选  22-23
    3.1.1 筛子及β-葡萄糖苷酶的酶活测定方法的确立  22-23
    3.1.2 通过比色法测酶活复筛  23
  3.2 产β-葡萄糖苷酶菌株的鉴定  23-25
    3.2.1 形态观察  23-24
    3.2.2 分子鉴定——18s rDNA分析  24-25
  3.3 筛选的β-葡萄糖苷酶的实际应用效果  25-30
    3.3.1 β-葡萄糖苷酶对萜类物质的影响  26-28
    3.3.2 β-葡萄糖苷酶对其他香气物质的影响  28-30
  3.4 对筛选出的黑曲霉菌株N~+离子束诱变  30-31
    3.4.1 离子注入剂量的确定  30-31
    3.4.2 黑曲霉高产菌株的筛选  31
  3.5 对发酵产β-葡萄糖苷酶的培养基优化研究  31-34
    3.5.1 碳源对β-葡萄糖苷酶酶活力的影响  31-32
    3.5.2 麸皮用量对β-葡萄糖苷酶酶活力的影响  32
    3.5.3 氮源对β-葡萄糖苷酶酶活力的影响  32-33
    3.5.4 接种量对β-葡萄糖苷酶酶活力的影响  33-34
  3.6 来源于黑曲霉的β-葡萄糖苷酶的分离纯化研究  34-40
    3.6.1 β-葡萄糖苷酶的纯化流程  34
    3.6.2 (NH_4)_2SO_4饱和度的选择  34-35
    3.6.3 离子交换层析及凝胶过滤层析分离β-葡萄糖苷酶  35-36
    3.6.4 β-葡萄糖苷酶的SDS-PAGE分析和分子量的确定  36-37
    3.6.5 β-葡萄糖苷酶的酶学性质的研究  37-40
  3.7 主要结论和展望  40-41
    3.7.1 主要结论  40
    3.7.2 展望  40-41
致谢  41-42
参考文献  42-47
附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文  47

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