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对虾肠道益生菌的筛选与免疫物质活性评价指标的建立

作　者: 李海兵
导　师: 宋晓玲；李赟
学　校: 中国海洋大学
专　业: 水产养殖
关键词: 对虾 免疫因子 WSSV 肠道菌群 益生菌 鳗弧菌疫苗
分类号: S917.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


近年来,频繁发生的病毒性和细菌性疾病,使对虾养殖业蒙受了巨大损失,严重制约了该产业的可持续发展。在认识到使用抗生素等药物的负面影响后,人们己把注意力转移到调动或激活虾类自身的免疫系统。对虾的免疫机能与对虾的健康密切相关。免疫增强剂能提高动物的免疫机能,促进动物的健康,增强动物的抗病力。因此,对虾高效免疫增强剂的筛选和筛选方法的建立便成为了此项研究的重点。本研究分为5部分:中国对虾各个生长阶段的肠道菌群及其安全性的研究,对虾肠道细菌中病原菌拮抗菌的筛选及其益生作用,以上两部分旨在为有突出免疫激活效果益生菌或细菌成分的筛选与组合奠定基础;凡纳滨对虾受病原侵染后某些免疫因子的变化规律,旨在建立对虾免疫物质活性评价的敏感指标,同时探讨了克氏原螯虾能否作为一种模式动物来进行对虾免疫增强剂的筛选;最后一部分为牙鲆鳗弧菌疫苗及抗体对中国对虾的保护作用。中国对虾各生长阶段肠道可培养的菌群分析:本试验对中国对虾各个生长阶段的肠道菌群数量和种类进行了研究分析,结果显示:从卵到成虾到亲虾肠道细菌数量不断增加,其细菌数量在3×107-4×108 cfu/g范围内;细菌种类也在不断增加,卵到仔虾的肠道细菌中主要优势菌为芽胞杆菌,该阶段中卵、无节幼体仅含有芽胞杆菌,蚤状幼体时细菌种类开始增多,出现了副溶血弧菌和溶藻胶弧菌,到糠虾幼体又增加了交替假单胞菌和曲挠杆菌,到仔虾期又增加了根瘤菌和哈维氏弧菌;成虾和亲虾则以弧菌和杆菌为优势菌,细菌种类也增加了坎贝尔弧菌、交替假单胞菌、发光杆菌、微小杆菌和鞘氨醇单胞菌数种。中国对虾肠道细菌的安全性研究:本试验分别给中国对虾(Penaeus chinensis)注射从健康中国对虾肠道内分离的几株可培养细菌PC070460、PC070461、PC070462、PC070463、PC070368、PC070370、PC070373、PC070374、PC070375和PC070376,计算其累计死亡率,观察它们对中国对虾的安全性。结果显示:高剂量的菌株PC070461和PC070374对中国对虾有致病性(P<0.05),而低剂量的PC070461和PC070374却使中国对虾的累计死亡率降低,对对虾起到保护作用;菌株PC070462和PC070373对中国对虾有保护作用,能显著提高中国对虾成活率(P<0.05);低剂量的菌株PC070463对中国对虾有明显的保护作用(P<0.05),而高剂量的却无此作用;菌株PC070376为对虾弱毒菌,该菌对中国对虾有一定的致病性。4株对虾肠道益生菌的分离及筛选:用体外拮抗试验的方法,先从不同生长阶段的对虾肠道中分离的96株细菌中筛选出4株对病原菌(鳗弧菌、副溶血弧菌和哈维氏弧菌等)有拮抗作用的细菌。通过固体扩散法和液体混合法确定其拮抗作用,之后进行安全性实验,证明它们对对虾无害。进行了常规生理生化和细菌鉴定系统测试,并测定了其16S rRNA基因序列,分析了相关细菌相应序列的同源性,构建了系统发生树,最终鉴定结果为:LV060806、LV060808为Vibrio natriegens;LV060810、LV060815为Vibrio alginolyticus。WSSV感染过程中凡纳滨对虾的免疫特性分析:以WSSV感染的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)为材料,分别用化学方法、基因定量方法比较了酚氧化酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、抗菌肽、溶菌酶等免疫因子在攻毒后各时间段的相对活性。结果显示:凡纳滨对虾受病原刺激后,各免疫指标随虾体健康程度改变有明显的应激反应,且变化显著。在受低剂量WSSV感染后,5 d内各组酶活力均升高,明显高于对照组(P<0.05),5 d后便低于对照组或与对照组处于同一水平。受高剂量WSSV感染后,酚氧化酶和溶菌酶活力均升高,而且显著高于对照组水平(P<0.05),直到实验结束;酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、抗菌肽活力则分别在WSSV感染后升高,明显高于对照组水平(P<0.05),而1 d后降至低于对照组水平。由此证实WSSV感染对虾时,其血清酚氧化酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、抗菌肽、溶菌酶都会发生明显的变化,且这种变化的整体趋势是先高后低,但升高维持的时间随着免疫因子的不同,病毒感染剂量的高低有所不同。结果提示以上免疫指标,尤其是溶菌酶和抗菌肽的基因表达可作为WSSV感染的敏感指标,进一步研究病毒感染的分子机理,或作为筛选对虾免疫活性物质的依据。WSSV感染对克氏原螯虾血细胞吞噬和肝胰腺磷酸酶活性的影响:本试验分析了人工感染白斑综合征病毒(White Spot Syndrom Virus, WSSV)后,克氏原螯虾(Procambarus clarkia)血细胞吞噬(Phagocytosis),肝胰腺酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)的变化,为WSSV感染与螯虾的免疫防御反应等研究提供依据。结果显示:随着WSSV感染克氏原螯虾时间的延长,血细胞吞噬活性,肝胰腺ACP和AKP活性也随之改变,其中血细胞吞噬活性的变化规律更为明显,可以用于间接指示克氏原螯虾的健康状况指标。而ACP与AKP的变化规律并不十分明显,在不同的感染时间内其变化规律不同。鳗弧菌疫苗对中国对虾鳗弧菌人工感染的免疫保护作用:本试验分别给中国对虾(Penaeus chinensis)注射鳗弧菌灭活疫苗和鳗弧菌疫苗在牙鲆体内产生的抗血清,之后注射鳗弧菌,计算其累计死亡率与保护率,观察它们对中国对虾的免疫保护情况。结果显示:鳗弧菌疫苗和抗体均对中国对虾有一定的免疫保护作用,其累计死亡率分别为25.82%、9.09%,均显著低于对照组(P<0.05),在7 d内抗体的保护作用更强一些,其免疫保护率达80.45%。

全文目录


摘要  5-8
Abstract  8-15
0 前言  15-43
  1 水产动物益生菌的研究进展  15-26
    1.1 概念  15-16
    1.2 研究现状  16-19
    1.3 应用  19-22
    1.4 存在问题及发展前景  22-23
    参考文献  23-26
  2 对虾的免疫机制及机制的诱导与激活  26-43
    2.1 对虾的细胞免疫  26-27
    2.2 对虾的体液免疫  27-32
    2.3 对虾的特异性免疫  32-33
    2.4 虾类免疫机制的诱导及激活  33-36
    2.5 结语  36-37
    参考文献  37-43
第一章 中国对虾各生长阶段肠道可培养的菌群分析  43-49
  1 材料与方法  43-44
    1.1 健康养殖中国对虾  43-44
    1.2 培养基  44
    1.3 均质样品的制备  44
    1.4 细菌数量的测定及试验菌株的分离、纯化  44
    1.5 细菌的鉴定  44
  2 结果  44-47
    2.1 各生长阶段肠道的细菌数量  44-45
    2.2 各生长阶段肠道细菌组成及种类鉴定结果  45-47
  3 讨论  47
  参考文献  47-49
第二章 中国对虾肠道细菌的安全性研究  49-55
  1 材料与方法  49-50
    1.1 对虾肠道细菌  49
    1.2 试验对虾  49-50
    1.3 试验方法  50
    1.4 数据处理  50
  2 结果  50-53
  3 讨论  53-54
  参考文献  54-55
第三章 4 株对虾肠道益生菌的筛选及鉴定  55-71
  1 材料与方法  55-58
    1.1 细菌的分离与培养  55
    1.2 拮抗菌的筛选  55-56
    1.3 拮抗物质的反应动力学  56
    1.4 溶血素的产生  56
    1.5 安全性试验  56
    1.6 益生菌的生长特性  56-57
    1.7 益生菌的鉴定  57-58
    1.8 统计分析  58
  2 结果  58-68
    2.1 拮抗菌的筛选  58
    2.2 拮抗物质的反应动力学  58-60
    2.3 拮抗菌的安全性试验  60-61
    2.4 益生菌的生长特性  61
    2.5 菌株生化特性分析  61-62
    2.6 菌落PCR 电泳结果  62-63
    2.7 16S rRNA 基因序列分析和系统发育树构建  63-68
  3 讨论  68
  参考文献  68-71
第四章 WSSV 感染过程中凡纳滨对虾的免疫特性分析  71-89
  1 材料和方法  72-77
    1.1 试验动物  72
    1.2 感染毒种制备  72
    1.3 WSSV 对克氏原螯虾LD_(50) 的确定  72
    1.4 WSSV 感染试验和材料收集  72-73
    1.5 日常管理  73
    1.6 底物酶促反应测定对虾免疫酶活性  73-74
    1.7 Real-time PCR 测定对虾免疫酶活性  74-77
    1.8 WSSV 的检测  77
  2 结果  77-85
    2.1 WSSV 对克氏原螯虾LD50 的测定结果  77
    2.2 Real-time PCR 条件摸索及引物筛选结果  77-79
    2.3 WSSV 感染过程中对虾各项免疫指标的测定结果  79-84
    2.4 WSSV 检测结果  84-85
  3 讨论  85-87
  参考文献  87-89
第五章 WSSV 感染对克氏原螯虾血细胞吞噬和肝胰腺磷酸酶活性的影响  89-99
  1 材料和方法  89-91
    1.1 试验动物  89
    1.2 感染毒种制备  89-90
    1.3 WSSV 对克氏原螯虾LD_(50) 的确定  90
    1.4 WSSV 感染试验和材料收集  90
    1.5 螯虾免疫指标测定  90-91
    1.6 WSSV 的检测  91
  2 结果  91-96
    2.1 WSSV 对克氏原螯虾LD50 的测定结果  91-92
    2.2 吞噬活性测定  92-93
    2.3 酸性磷酸酶活性的变化  93-94
    2.4 碱性磷酸酶活性的变化  94
    2.5 WSSV 检测结果  94-96
  3 讨论  96-97
  参考文献  97-99
第六章 鳗弧菌疫苗对中国对虾鳗弧菌人工感染的免疫保护作用  99-105
  1 材料与方法  99-100
    1.1 试验对虾  99
    1.2 试验菌株  99
    1.3 疫苗的制备  99-100
    1.4 抗体的制备  100
    1.5 疫苗、抗血清的注射及鳗弧菌人工感染  100
    1.6 统计分析  100
  2 结果  100-102
    2.1 抗原的灭活效果及蛋白含量的测定  100-101
    2.2 血清抗体效价  101
    2.3 累计死亡率与保护率的结果  101-102
  3 讨论  102-103
  参考文献  103-105
附录使用试剂的配制  105-111
致谢  111-113
个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果  113

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