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新金色分枝杆菌中AD转化为ADD关键酶KSDD的研究

作　者: 韩冷
导　师: 饶志明
学　校: 江南大学
专　业: 微生物学
关键词: 植物甾醇 雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD) 雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD) 3-甾酮-△~1-脱氢酶
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


甾体药物作为仅次于抗生素第二大类药物,在日常生活中具有很广泛的应用。雄甾-4-烯-3,17-二酮(androst-4-end-3,17-dione, AD)和雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(androst-1,4-end-3,17-dione, ADD)是微生物转化植物甾醇过程中的重要产物,是重要的甾体药物中间体,可以作为合成甾体药物的前体物质。3-甾酮-△’-脱氢酶(KSDD)是微生物转化植物甾醇过程中的关键酶,对AD(D)合成有重要影响。本实验室保藏了一株能够转化植物甾醇为AD(D)的新金色分枝杆菌((Mycobacterium neoaurum),因此以该菌为基础从多个方面对KSDD的性质和功能进行了研究。首先克隆了该菌株KSDD编码基因ksdD的1.7 kb全序列,连接pET-28a表达载体后在大肠杆菌E. coli BL21中诱导表达,但是表达出的KSDD酶蛋白以无活性的包涵体形式存在。通过优化诱导条件,降低蛋白表达量,KSDD重组蛋白仍然以包涵体形式存在。为了验证ksdD基因在分枝杆菌中的功能,利用PCR方法扩增出pET-28a质粒上1.4kb的卡那霉素抗性基因Km,构建了非复制型整合载体pMD18-T-ksdD::Km用于敲除ksdD基因。电击转化分枝杆菌M. neoaurum JC-12,经过表型和基因型验证,证实了原始菌株M. neoaurum JC-12中ksdD基因缺失。对菌株生长曲线测定显示,ksdD基因缺失对重组菌生长无影响；酶活检测显示重组菌KSDD酶活为15.6 mU/mg,与原始菌株相比下降了85%；甾醇转化实验发现重组菌AD产量为0.336 g/L,与原始菌株相比提升了1倍。为了实现ksdD基因在分枝杆菌M. neoaurum中的过量表达,将ksdD基因置于卡那霉素抗性基因启动子Pkan下游,并利用该菌的16S rDNA序列作为整合区域,构建了载体pETPkan-ksdD-16SrDNA。电击转化分枝杆菌M. neoaurum JC-12,经过表型和基因型验证,证实了Pkan-ksdD表达序列成功整合至原始菌株染色体上。对菌株生长曲线测定显示,ksdD基因过量表达对重组菌生长无影响；酶活检测显示重组菌KSDD酶活为157.3 mU/mg,与原始菌株相比提升了42.4%；甾醇转化实验发现重组菌ADD产量为1.246 g/L,与原始菌株相比提升了24.8%。以上结果说明KSDD是AD合成ADD过程中的关键酶,为今后进一步研究奠定了基础。

全文目录


摘要  3-4
Abstract  4-8
第一章 引言  8-16
  1.1 甾体药物研究进展  8-10
    1.1.1 甾体化合物概述  8
    1.1.2 甾体药物概述  8-9
    1.1.3 雄甾烯酮概述  9-10
  1.2 植物甾醇微生物转化合成AD(D)的研究进展  10-12
    1.2.1 选择性甾体边链降解技术  10-11
    1.2.2 甾醇新型转化体系研究进展  11-12
  1.3 甾体微生物转化过程中关键酶KSDD研究  12-13
    1.3.1 KSDD的性质  12
    1.3.2 KSDD研究进展  12-13
  1.4 本课题立题意义和主要研究任务  13-16
第二章 实验材料与方法  16-22
  2.1 实验材料  16-17
    2.1.1 实验仪器  16
    2.1.2 菌株与质粒  16
    2.1.3 工具酶与试剂  16-17
    2.1.4 培养基及培养条件  17
  2.2 实验方法  17-22
    2.2.1 PCR引物  17-18
    2.2.2 分枝杆菌染色体DNA的制备  18
    2.2.3 PCR反应体系及反应条件  18
    2.2.4 PCR产物回收以及与pMD18-T vector连接  18
    2.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备  18-19
    2.2.6 大肠杆菌热击转化  19
    2.2.7 转化子的筛选与鉴定  19
    2.2.8 质粒提取步骤  19
    2.2.9 大肠杆菌重组表达载体的构建及ksdD基因的诱导表达  19
    2.2.10 重组大肠杆菌SDS-PAGE分析  19
    2.2.11 分枝杆菌感受态细胞制备  19-20
    2.2.12 分枝杆菌电击转化  20
    2.2.13 转化子的筛选与鉴定  20
    2.2.14 分枝杆菌KSDD酶活测定方法  20-21
    2.2.15 产物雄甾烯酮检测方法  21-22
第三章 结果与讨论  22-41
  3.1 ksdD基因在大肠杆菌中的过量表达及其酶活检测  22-27
    3.1.1 分枝杆菌ksdD基因的克隆及核苷酸序列分析  22-23
    3.1.2 大肠杆菌重组表达载体pET-28a-ksdD的构建  23-25
    3.1.3 ksdD基因在大肠杆菌中表达  25
    3.1.4 重组大肠杆菌质粒稳定性分析  25-26
    3.1.5 重组大肠杆菌SDS-PAGE分析  26
    3.1.6 重组菌3-甾酮-△~1-脱氢酶酶活测定  26
    3.1.7 KSDD诱导表达条件优化  26-27
    3.1.8 小结  27
  3.2 ksdD基因敲除及其对菌株AD(D)合成的影响  27-33
    3.2.1 ksdD基因敲除载体pMD18-T-ksdD::Km的构建  27-29
    3.2.2 以基因元件ksdD::Km电转化分枝杆菌  29
    3.2.3 ksdD基因缺失阳性转化子的筛选  29-30
    3.2.4 ksdD基因缺失对菌株生长的影响  30-31
    3.2.5 M.neoaurum(ksdD::Km)KSDD酶活力测定  31-32
    3.2.6 M.neoaurum(ksdD::Km)甾醇转化实验  32
    3.2.7 小结  32-33
  3.3 ksdD基因整合及其对菌株AD(D)合成的影响  33-41
    3.3.1 ksdD基因整合载体pETPkan-ksdD-16SrDNA构建  33-36
    3.3.2 以线性化的基因元件pETPkan-ksdD-16SrDNA电转化分枝杆菌  36-37
    3.3.3 ksdD基因整合阳性转化子筛选  37-38
    3.3.4 ksdD基因过量表达对菌株生长的影响  38-39
    3.3.5 M.neoaurum(Pkan-ksdD)KSDD酶活力测定  39
    3.3.6 M.neoaurum(Pkan-ksdD)甾醇转化实验  39-40
    3.3.7 小结  40-41
结论与展望  41-43
致谢  43-44
参考文献  44-49
附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文  49

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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