学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

Mycobacterium neoaurum NwIB-01降解甾醇母核关键酶3-甾酮-△~1-脱氢酶和3-甾酮-9α-羟化酶基因的鉴定及其基因工程改造

作　者: 魏巍
导　师: 魏东芝
学　校: 华东理工大学
专　业: 生物化工
关键词: 新金分枝杆菌 3-甾酮-△~1-脱氢酶 3-甾酮-9α-羟基化酶 植物甾醇 雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)
分类号: Q78
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
下　载: 176次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


甾体类药物具有重要的生理活性,在临床上有广泛的应用,是仅次于抗生素的第二大类药物。目前甾体药物生产中常用的方法有化学合成和微生物转化两种,其中微生物转化法显示出其巨大的优势。分枝杆菌可降解植物甾醇生成系列代谢中间体,例如雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)、雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)、9a-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-OH-AD)等,这些产物可作为前体用于制备临床甾体药物。国内对生产甾体菌种的研究仅限于简单筛选诱变,并未对菌种在分子水平上进行深入的探索,这也限制了国内甾体药物生产的进一步发展,而在国外,上述研究已经展开并进展迅速。随着分子生物学的发展和人们对甾体代谢机制研究的深入,基因工程在甾体药物生产中必将得到广泛的应用。本课题针对本研究室新筛选的一株具有应用前景的新金分枝杆菌NwIB-01 (Mycobacterium neoaurum NwIB-01),从基因水平上对甾体转化过程中的关键酶进行研究并在此基础上通过基因操作对筛选菌种的生产性状进行改良。NwIB-01能够转化植物甾醇同时生成AD与ADD,但AD与ADD结构相似,在工业生产中很难进行分离,这限制了该菌的进一步应用。基于此考虑,我们从NwIB-01中克隆出AD(D)相互转化并积累的关键酶基因,3-甾酮-△’-脱氢酶(KsdD)及3-甾酮-9α-羟基化酶(KSH)基因,进而,通过基因工程的方法对这些关键酶进行了基因敲除强化等分子操作并初步构建了具有应用前景积累ADD的基因工程菌,上述基因都是在新金分枝杆菌中的首次报道。具体而言,本论文主要做了以下工作：1.菌种的筛选及性状研究鉴定出一株新金分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum NwIB-01),在3.7-L发酵罐中NwIB-01可以转化15g/l的植物甾醇生成1.76g/l的AD及4.23 g/1 ADD,底物的摩尔转化率为57.8%。2.关键基因3-甾酮-△1-脱氢酶基因(ksdDM)的研究首次在新金分枝杆菌中克隆出3-甾酮-△1-脱氢酶的全序列。分析表明,ksdDM大小1701 bp,以GTG为起始密码子,可能的核糖体结合位点为其上游的GAAAGG序列,该基因与Mycobacterium smegmatis str. MC2155 (Genbank CP000480) ksdD的核苷酸序列一致性为82%(NCBI最高序列一致性)。通过pET系列质粒实现了ksdDM在大肠杆菌BL21(DE3)中的异源表达,pET-22b所表达的KsdDM酶活为0.8 U／mg蛋白。3.关键基因3-甾酮-9α-羟基化酶基因(kshA)及3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶基因(kshB)的研究通过设计简并引物和基因走读的方法,分别得到了kshA及kshB基因的全长序列。kshA大小1188 bp,以GTG为起始密码子,其核糖体结合位点为以其上游的GGGAGG序列,这是kshA在新金分枝杆菌中的首次报道。kshA与NCBI中Mycobacterium smegmatis str. MC2155 (Genbank ACV87349)的核苷酸序列一致性为85%(NCBI最高序列一致性)。利用大肠杆菌表达载体pET-22b对kshA进行了克隆表达及全菌转化实验,同时将基因kshA及kshB在载体pET-22b中进行了共表达。4.3-甾酮-△1-脱氢酶基因(ksdDM)的无标记敲除利用分枝杆菌基因敲除质粒p2NIL和pGOAL19构建ksdDM自杀质粒,通过双交换基因重组技术实现目的基因的无标记敲除。ksdDM基因敲除菌(重组分枝杆菌NwIB-02)主要积累AD,在含0.1 g/L底物的摇瓶实验中,发酵96 h后,产物中AD和ADD的摩尔比为11.5：1,而野生菌主要积累ADD (AD:ADD=1:2.4)。5.3-甾酮-／△1-脱氢酶基因(ksdDM)的强化表达和产ADD基因工程菌的构建利用分枝杆菌复制型质粒pMV261及整合型质粒pMV306,将ksdDM在新金分枝杆菌NwIB-01中进行强化表达,构建分枝杆菌强化表达菌株NwIB-03及NwIB-04。发酵实验表明,NwIB-04在3.7-L发酵罐上产物中ADD的产量在加入底物96 h后达到最大值4.94g/l,此时AD的含量只有0.096g/l,产物中AD与ADD的摩尔比为AD:ADD=1:51.5。最终产物中ADD的纯度超过95%。6.甾体降解基因簇研究利用质粒pCC2FOS,构建新金分枝杆菌NwIB-01的Fosmid基因组文库,通过筛选及测序,得到了大约81 kb的基因簇序列并找到了多个甾体代谢关键酶。综上所述,本论文首次克隆出新金分枝杆菌中负责甾体代谢的关键基因ksdDM、kshA及kshB,并通过基因工程的方法改良了菌株的生产特性,得到了生产ADD的基因工程菌,这为甾体生产菌株的基因改良及甾体药物中间体的制备奠定了基础。

全文目录


摘要  5-7
Abstract  7-10
目录  10-14
第1章 文献综述  14-36
  1.1 甾体化合物及其微生物转化  14-20
    1.1.1 甾体化合物及甾体药物  14-16
    1.1.2 甾体化合物的微生物转化  16-20
      1.1.2.1 甾体化合物的微生物转化概述  16-17
      1.1.2.2 甾体化合物微生物转化的反应类型  17
      1.1.2.3 植物甾醇及甾醇侧链降解  17-20
  1.2 3-甾酮-△~1-脱氢酶(KsdD)  20-24
    1.2.1 3-甾酮-△~1-脱氢反应概况  20-21
    1.2.2 3-甾酮-△~1-脱氢酶的反应机理  21-22
    1.2.3 3-甾酮-△~1-脱氢酶氨基酸序列分析  22-23
    1.2.4 3-甾酮-△~1-脱氢酶的异源表达  23-24
  1.3 3-甾酮-9A-羟基化酶(KSH)  24-28
    1.3.1 3-甾酮-9α-羟基化反应概况  24-25
    1.3.2 3-甾酮-9α-羟基化酶的酶学分类  25-27
    1.3.3 3-甾酮-9α-羟基化酶的抑制  27-28
  1.4 分枝杆菌降解甾醇侧链的国内外相关研究现状及最新发展动态分析  28-33
    1.4.1 分枝杆菌概况及在甾体代谢上的研究  28-29
    1.4.2 国内外相关研究现状  29-31
      1.4.2.1 菌种选育  29-30
      1.4.2.2 培养基优化  30
      1.4.2.3 发酵系统的研究  30-31
    1.4.3 甾醇降解机制最新发展动态分析  31-33
    1.4.4 构建甾醇降解基因工程菌的研究进展  33
  1.5 本课题的研究目的与内容  33-36
    1.5.1 课题背景  33-35
    1.5.2 本课题的研究内容及目标  35-36
第2章 新金分枝杆菌NwIB-01的筛选鉴定、生长特性研究  36-50
  2.1 引言  36
  2.2 材料与方法  36-42
    2.2.1 实验材料  36-38
      2.2.1.1 实验药品及仪器  36-37
      2.2.1.2 菌株  37
      2.2.1.3 培养基  37-38
    2.2.2 实验方法  38-42
      2.2.2.1 植物甾醇的乳化  38
      2.2.2.2 微生物的富集、分离与纯培养  38-39
      2.2.2.3 转化产物分析  39
      2.2.2.4 菌种鉴定  39-41
      2.2.2.5 菌种生长分析  41-42
  2.3 结果与分析  42-48
    2.3.1 微生物筛选鉴定  42-46
      2.3.1.1 微生物的形态观察  42-43
      2.3.1.2 NwIB-01的植物甾醇转化实验  43-44
      2.3.1.3 微生物的16SrDNA鉴定  44-46
    2.3.2 NwIB-01的生长特性及培养基选择  46-48
  2.4 本章小结  48-50
第3章 新金分枝杆菌NwIB-01中3-酮-4-烯类固醇化合物C_(1,2)位脱氢反应关键基因的克隆和酶学分析  50-79
  3.1 引言  50
  3.2 材料与方法  50-66
    3.2.1 实验材料  50-54
      3.2.1.1 菌株及质粒  50-51
      3.2.1.2 培养基及试剂  51-53
      3.2.1.3 实验药品及仪器  53-54
    3.2.2 实验方法  54-66
      3.2.2.1 菌种保藏  55
      3.2.2.2 染色体DNA的制备  55
      3.2.2.3 大肠杆菌质粒质粒DNA的提取  55-56
      3.2.2.4 DNA片段的凝胶电泳回收  56
      3.2.2.5 小量PCR产物的纯化  56
      3.2.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备  56-57
      3.2.2.7 T载体克隆  57
      3.2.2.8 转化和筛选  57
      3.2.2.9 阳性重组子的鉴定  57-58
      3.2.2.10 引物设计  58
      3.2.2.11 基因走读Genome-Walking及基因全长的获得  58-60
      3.2.2.12 表达质粒的构建  60-61
      3.2.2.13 蛋白质的原核表达及SDS-PAGE检测  61-62
      3.2.2.14 重组菌诱导优化  62-63
      3.2.2.15 大肠杆菌细胞破碎  63
      3.2.2.16 Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱分离纯化  63
      3.2.2.17 透析  63-64
      3.2.2.18 总蛋白含量测定  64-65
      3.2.2.19 3-甾酮-△~1-脱氢酶酶活测定  65
      3.2.2.20 基因工程大肠杆菌转化AD实验  65
      3.2.2.21 基因序列的简单生物信息学分析  65-66
  3.3 结果与分析  66-77
    3.3.1 NwIB-01中3-甾酮-△~1-脱氢酶基因保守序列的克隆  66-68
      3.3.1.1 分枝杆菌基因组提取方法改进  66-67
      3.3.1.2 分枝杆菌3-甾酮-△~1-脱氢酶保守序列的扩增  67-68
    3.3.2 NwIB-01中3-甾酮-△~1-脱氢酶基因全序列的克隆  68-70
    3.3.3 构建pET-22b-ksdD_M和pET-32a-ksdD_M表达载体  70-71
    3.3.4 3-甾酮-△~1-脱氢酶的优化表达  71-74
      3.3.4.1 重组pET-22b-ksdD_M和pET-32a-ksdD_M的诱导表达  71-72
      3.3.4.2 表达条件的优化  72-73
      3.3.4.3 蛋白纯化  73-74
    3.3.5 酶活测定  74
    3.3.6 大肠杆菌全细胞转化实验  74-75
    3.3.7 生物信息学分析  75-77
      3.3.7.1 3-甾酮-△~1-脱氢酶的基因分析  75-76
      3.3.7.2 3-甾酮-△~1-脱氢酶的跨膜结构分析  76-77
  3.4 本章小结  77-79
第4章 新金分枝杆菌NwIB-01中甾体9α-羟基化反应关键基因的克隆和酶学分析  79-99
  4.1 引言  79
  4.2 材料与方法  79-84
    4.2.1 实验材料  79-80
    4.2.2 实验方法  80-84
      4.2.2.1 常规分子生物学实验方法  80
      4.2.2.2 3-甾酮-9α-羟基化酶(KshA)的引物设计  80-81
      4.2.2.3 3-甾酮-9α-羟基化酶(KshA)的保守序列的扩增  81
      4.2.2.4 3-甾酮-9α-羟基化酶的染色体走读  81
      4.2.2.5 3-甾酮-9α-羟基化酶全长基因的克隆  81-82
      4.2.2.6 3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶(KshB)保守序列的扩增  82
      4.2.2.7 3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶(KshB)全长序列的克隆  82
      4.2.2.8 重组质粒的构建  82
      4.2.2.9 重组pET32-ksh的诱导表达  82-83
      4.2.2.10 表达产物鉴定  83
      4.2.2.11 表达蛋白KshA的分离纯化  83
      4.2.2.12 3-甾酮-9α-羟基化酶及其还原酶基因的共表达  83-84
  4.3 结果与分析  84-97
    4.3.1 3-甾酮-9α-羟基化酶基因保守序列的扩增  84
    4.3.2 3-甾酮-9α-羟基化酶基因全长的克隆  84-85
    4.3.3 3-甾酮-9α-羟基化酶序列及进化树分析  85-90
      4.3.3.1 开放阅读框(ORF)的确定及蛋白一级结构分析  85-87
      4.3.3.2 KshA的二级结构及结构域预测  87-89
      4.3.3.3 基因进化树及保守结构域分析  89-90
    4.3.4 重组质粒的构建及转化  90-91
    4.3.5 KSH的诱导表达优化及蛋白纯化  91-92
    4.3.6 全菌转化  92
    4.3.7 3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶(KshB)基因的克隆  92-93
    4.3.8 3-甾酮-9α-羟基化酶及其还原酶的共表达  93-97
  4.4 本章小结  97-99
第5章 新金分枝杆菌NwIB-01中3-甾酮-9α-羟基化酶(KshA)及3-甾酮-△~1-脱氢酶(KsdD)的基因敲除  99-117
  5.1 引言  99
  5.2 材料与方法  99-107
    5.2.1 实验材料  99-101
      5.2.1.1 菌株和质粒  99-100
      5.2.1.2 实验试剂及器材  100-101
    5.2.2 实验方法  101-107
      5.2.2.1 KsdD自杀敲除质粒的构建  101-103
      5.2.2.2 KsdD敲除工程菌阳性克隆子的筛选  103-106
      5.2.2.3 KSH自杀敲除质粒的构建  106-107
      5.2.2.4 KSH敲除工程菌阳性克隆子的筛选  107
      5.2.2.5 KsdD及KshA基因敲除工程菌的验证  107
  5.3 实验结果  107-116
    5.3.1 KsdD上下游序列的扩增  107-109
    5.3.2 KsdD敲除质粒的构建  109-110
    5.3.3 KsdD基因敲除突变菌的筛选  110-111
    5.3.4 KsdD基因敲除突变菌的表型及生产特征鉴定  111-113
    5.3.5 KshA基因上下游序列的克隆及敲除质粒的构建  113-116
  5.4 本章小结  116-117
第6章 新金分枝杆菌NwIB-01中3-甾酮-△~1-脱氢酶(KsdD)的基因强化表达及基因工程菌ADD发酵试验初探  117-127
  6.1 引言  117
  6.2 材料与方法  117-120
    6.2.1 实验材料  117-118
      6.2.1.1 菌株和质粒  117-118
      6.2.1.2 实验试剂及器材  118
    6.2.2 实验方法  118-120
      6.2.2.1 KsdD穿梭表达质粒(pMV261-ksdDM)的构建  118-119
      6.2.2.2 KsdD整合表达质粒(pMV306-ksdDM)的构建  119-120
      6.2.2.3 重组分枝杆菌的构建  120
      6.2.2.4 重组分枝杆菌的稳定性分析  120
      6.2.2.5 重组分枝杆菌NwIB-04的发酵初探  120
      6.2.2.6 重组分枝杆菌NwIB-04的转化反应及产物分析  120
  6.3 实验结果与分析  120-125
    6.3.1 重组质粒pMV261-ksdD_M的构建  120-121
    6.3.2 重组质粒pMV306-ksdD_M的构建  121-122
    6.3.3 重组分枝杆菌重组子的鉴定  122-123
    6.3.4 重组分枝杆菌的稳定性分析  123
    6.3.5 重组分枝杆菌NwIB-04的性状检测及发酵放大实验  123-125
  6.4 本章小结  125-127
第7章 课题最新进展及结论与展望  127-134
  7.1 课题最新进展-甾体降解基因簇的研究  127-130
  7.2 结论  130-132
  7.3 课题研究展望  132-134
参考文献  134-143
致谢  143-144
博士期间发表的论文与专利  144-145
附录一 缩写词和英汉对照  145-146
附录二 NCBI提交序列信息  146-151

相似论文

  1. 植物甾醇在奶牛上的应用及其机理初探,S823
  2. 植物甾醇衍生物合成及抗肿瘤活性的研究和γ-倒捻子素化合物的合成研究,TQ464
  3. 新金色分枝杆菌中AD转化为ADD关键酶KSDD的研究,Q78
  4. 植物甾醇的氢化,O629.21
  5. 菜籽油脱臭馏出物中天然V_E和植物甾醇提取工艺研究,TQ466.5
  6. 植物甾醇降血脂作用的研究,R285
  7. 烟草中高级烷醇、植物甾醇及茄尼醇分析研究,TS411
  8. 菜籽植物甾醇的提取、纯化及抗氧化活性研究,TQ645.98
  9. 中华秋海棠甾醇类化合物的提取、纯化及微胶囊化研究,TQ914.1
  10. 植物甾醇合成关键酶基因OsSQS遗传转化水稻的研究,Q943.2
  11. 我国保健食品常用原料植物甾醇分析方法的建立及应用研究,R155.5
  12. 大豆脱臭馏出物中生育酚及甾醇单体的分离纯化,TQ914.1
  13. 外加因子对两相系统转化植物甾醇制备雄烯二酮的影响,TQ463
  14. 植物甾醇乳化的研究,TQ645.98
  15. 转化植物甾醇单产雄甾雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮菌株的诱变选育及产物初步提取,Q93
  16. 植物甾醇酯的化学合成及其抗氧化性研究,TS202.3
  17. 植物甾醇的提取研究,TQ645.98
  18. 转化植物甾醇为雄甾烯酮菌株的筛选鉴定及发酵工艺的研究,TQ464
  19. 植物甾醇内酯及其类似物的合成研究,TQ645.9
  20. 翅果油中植物甾醇的提取分离与结构分析,TQ645.9
  21. 植物甾醇对肉用仔鸡养分利用及生产性能的影响,S831.5

中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
© 2012 www.xueweilunwen.com