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两种星鲽组织细胞系的建立及久效磷对其毒性作用的研究

作　者: 徐晓辉
导　师: 樊廷俊
学　校: 中国海洋大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 条斑星鲽圆斑星鲽鳍细胞系鳃细胞系久效磷毒性作用
分类号: X174
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

鱼类细胞系是环境毒理学,病毒学,遗传学,免疫学,药理学等理想的体外研究体系,具有很高的实际应用价值。条斑星鲽(Verasper moseri)和圆斑星鲽(Verasper variegates)是近年来养殖业新兴的名贵鱼种,因其肉质鲜美,营养丰富,市场经济价值很高。本文研究了这两种鱼组织细胞系的建立,不仅可应用于其病害防治和新品种培育的研究,还可广泛用于鱼类的细胞毒理研究、病毒学研究、基因组研究、遗传育种、优质种质资源的保存等。其中,对海洋环境污染物的检测是其重要用途之一。近年来农林业病虫害频繁,各类农药被大量使用,其中有机磷农药因药效显著而在全世界范围内过量使用,严重污染了江河和地下水,最终进入海洋,造成海水中有机磷农药严重超标,导致鱼类死亡,也威胁到人类的健康安全。鱼类细胞系能够在细胞水平上快速、准确地评价环境污染物的毒性作用,为准确确定有机磷农药等环境污染物对海洋鱼类产生毒性作用的临界浓度、最终建立海洋生态环境健康评价标准提供基础性资料。为了建立星鲽组织细胞系,本文分别采用0.5%透明质酸酶-0.2%Ⅱ型胶原酶联合消化和0.25%胰蛋白酶消化的方法启动了条斑星鲽鳍组织和圆斑星鲽鳃组织的体外培养。在添加有100μg/mL羧甲基壳寡糖、10ng/mL碱性成纤维样生长因子、40ng/mL I型胰岛素样生长因子和20%胎牛血清(FBS)的DMEM/F-12、L15、M199培养液(pH7.2)中启动条斑星鲽鳍组织和圆斑星鲽鳃组织的体外培养,结果显示,DMEM/F-12均是两种细胞的最适培养基；分别在含有上述添加物的DMEM/F-12培养液中18℃、22℃、25℃进行条斑星鲽鳍组织和圆斑星鲽鳃组织的体外培养,结果显示,22℃均是两种细胞的最适培养温度。在此最适体系下启动条斑星鲽鳍组织和圆斑星鲽鳃组织的原代培养,结果显示,两种组织分别在第10天和第9天即有大量细胞迁出,迁出细胞透明度高,均为成纤维样细胞；分别在第20天和第30天长成单层,并且成功进行了继代培养。目前,条斑星鲽鳍细胞已继代培养至第135代,圆斑星鲽鳃细胞已继代培养至第80代,已经成功建立条斑星鲽鳍细胞连续性系和圆斑星鲽鳃细胞连续性系。第60代的条斑星鲽鳍细胞和圆斑星鲽鳃细胞的细胞生长曲线显示两种细胞的群体倍增时间分别35.1h和44.2h,表明细胞生长仍旧非常旺盛。对第60代的条斑星鲽鳍细胞和圆斑星鲽鳃细胞的染色体进行分析,发现两种细胞的染色体数依然都是46条；虽然出现了染色体数目的非整倍性,但通过染色体数目统计显示46条染色体细胞都占总细胞的70%以上,核型分析显示,两种细胞均具有正常的二倍体核型,分别为44t+2sm和46t,说明这两种细胞系确为条斑星鲽细胞系和圆斑星鲽细胞系。久效磷是有机磷农药使用中最为频繁的一种。本文采用MTT法和细胞蛋白含量测定法检测了久效磷对条斑星鲽鳍细胞和圆斑星鲽鳃细胞的毒性作用,发现1μg/mL久效磷都对两种细胞产生细胞毒性,且呈浓度依赖性。久效磷对条斑星鲽鳍细胞的48h-IC50分别为40.78和40.93μg/mL,对圆斑星鲽鳃细胞的48h-IC50分别为39.27和38.22μg/mL,每组数据的两个值比较接近,两种细胞的48h-IC50差别不大,且圆斑星鲽鳃细胞对久效磷比较敏感。20μg/mL浓度以上久效磷处理条斑星鲽鳍细胞和圆斑星鲽鳃细胞96h后,两种细胞都大量出现细胞变圆、脱落、凝聚等现象,表明久效磷对两种细胞的形态结构影响很大。实验表明,10μg/mL久效磷均可引起条斑星鲽鳍细胞谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和圆斑星鲽鳃细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性的显著变化,说明条斑星鲽鳍细胞和圆斑星鲽鳃细胞对久效磷的毒性反应灵敏,且条斑星鲽鳍细胞的GST和圆斑星鲽鳃细胞的SOD两种酶活可作为久效磷的生物学检测指标。

两种星鲽组织细胞系的建立及久效磷对其毒性作用的研究

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