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目的目前关节退行性变和各种创伤、运动损伤造成的软骨损伤逐日增多,已经成为临床上的常见病、多发病。由于关节软骨主要是由软骨细胞和周围的外基质组成的无血管组织,损伤后自我修复能力比较弱,并且以往常用的关节软骨钻孔、自体软骨膜、骨膜移植等治疗方法都难以取得理想的效果,以致关节软骨损伤成了临床上亟待解决的难题。近年来随着组织工程技术的迅速发展,为解决这一难题提供了机遇。人们利用软骨组织工程技术,将细胞及支架材料复合培养,修复软骨缺损已经取得初步成效。本课题体外分离骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs),经过某些生长因子诱导生成软骨细胞,将软骨细胞种植于胶原支架材料上并置于灌注型生物反应器中复合培养,观察细胞在支架材料上的黏附、伸展和增殖情况,期待找到理想的软骨组织工程种子细胞、支架材料、细胞因子和培养方法。材料和方法1取2-3月龄的健康新西兰大白兔,穿刺髂骨抽取骨髓6-8ml,梯度密度离心获取BMSCs,进行原代、传代细胞培养。按加入细胞因子的不同分为四组：A组：TGF-β1+bFGF；B组：TGF-β1+IGF-Ⅰ；C组：TGF-β1；D组：空白对照组。三组中都加入地塞米松10-7mmol／ml,Vitc 50ug／ml,含10%胎牛血清的低糖DMEM。每日倒置相差显微镜观察细胞的生长状况,诱导培养21d后,分别做四唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)比色试验观察细胞增殖状况,细胞培养上清液检测糖胺聚糖(glycosaminoglycan, GAG)含量,免疫细胞化学检测细胞Ⅱ型胶原的分泌,以观察BMSCs向软骨细胞方向分化的情况；2取诱导培养14d的B组BMSCs,调整细胞浓度为5x106／ml,分别种植于Ⅰ、Ⅱ型胶原支架,分为四组：1组：复合Ⅱ型胶原支架静置培养组；2组：复合Ⅱ型胶原支架生物反应器培养组；3组：复合Ⅰ型胶原支架静置培养组；4组：复合Ⅰ型胶原支架生物反应器培养组。7d后做HE、甲苯胺蓝染色,观察灌注型生物反应器条件下诱导后的兔骨髓间充质干细胞在Ⅰ、Ⅱ型胶原支架上黏附、伸展和增殖情况。取空白Ⅱ型胶原支架和生物反应器培养组的BMSCs和Ⅱ型胶原支架复合物进行扫描电镜观察,观察Ⅱ型胶原支架的结构、孔隙率和BMSCs在支架内的黏附、生长情况。结果1细胞形态学改变倒置相差显微镜观察：原代细胞24h可见少量细胞贴壁,呈短梭形。3d后可见小的细胞集落形成,7-8d细胞集落明显增大、变多。12-14d细胞长满瓶底。传代细胞贴壁快,呈均匀分布,6-7d长满瓶底,细胞核大,胞浆内颗粒变多。取P2代细胞进行微团诱导培养,加入细胞因子以后,细胞生长加快,微团的中央形成细胞团块,边缘细胞漩涡状生长。A、B、C组的边缘细胞逐渐变为多角形或多边形,体积变大,胞浆内颗粒增多,细胞核间隙增大,以A组和B组明显。D组则始终呈稠密的长梭形。2 MTT吸光度值、GAG含量检测和Ⅱ型胶原分泌结果均为：A组>C组>D组, B组>C组>D组；A、B、C三组Ⅱ型胶原免疫组织化学检测阳性,Ⅱ型胶原免疫组织化学阳性的BMSCs胞浆染色为黄色或棕黄色。3组织学观察：诱导后的BMSCs在Ⅱ型胶原支架上黏附、生长良好,细胞外基质丰富,甲苯胺蓝染色显示细胞周围异染基质,以生物反应器培养组为著；Ⅰ型胶原海绵支架孔隙率差,复合的细胞少见。Ⅱ型胶原支架内复合细胞的数量明显高于Ⅰ型胶原支架。对于相同支架生物反应器培养组复合细胞的数量明显高于静置培养组。电镜观察：扫描电镜显示Ⅱ型胶原支架纤维呈网架状结构,孔隙不规则,孔径在100-300μm之间,孔壁的厚度较均匀,为20-40μm,空隙率大于90%。复合材料显示BMSCs细胞在Ⅱ型胶原支架上黏附、伸展和增殖良好,可见到细胞分泌的基质和细胞伪足的铆钉作用,表明支架材料具有良好的细胞相容性。结论1 BMSCs是软骨组织工程理想的种子细胞。取材方便,易于分离和扩增,体外培养性能稳定,在一定诱导条件下,可分化为软骨细胞。2细胞因子在促进BMSCs增殖和向软骨细胞分化方面有重要意义。TGF-β1和IGF-Ⅰ、bFGF在BMSCs增殖和向软骨细胞分化时起协同作用。3三维微团培养法是目前诱导BMSCs向软骨方向分化的理想培养方法。4Ⅱ型胶原是理想的软骨组织工程支架材料。具有良好的组织相容性和孔隙率,BMSCs在其中可以很好地黏附、生长和增殖。5灌注型生物反应器使软骨细胞在胶原支架中存活并增殖,提高了细胞在载体内的复合效率。灌注型生物反应器培养环境有利于三维立体培养软骨细胞模块。
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