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蛋白酶体抑制剂—硼替佐米对自然杀伤细胞功能影响的研究

作　者: 冯晓丽
导　师: 王一彪；郑成云
学　校: 山东大学
专　业: 小儿内科学
关键词: 蛋白酶体抑制剂 自然杀伤细胞 TRAIL 细胞毒作用 多发性骨髓瘤细胞
分类号: R965
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


背景人体细胞内主要运用泛素-蛋白酶体(Ubiquitin-proteasome pathway,UPP)的蛋白水解酶体系调控细胞的增殖、分化和凋亡,所以蛋白酶体的活性状态对维持细胞的正常功能起重要作用。蛋白酶体抑制剂可通过抑制蛋白酶体活性进而干扰和影响细胞功能,对肿瘤细胞的生长有明显的抑制作用。硼替佐米(bortezomib, velcade)是近年来研究较多的一种蛋白酶体抑制剂,目前已被较广泛地应用于多发性骨髓瘤的治疗,此外它的抗肿瘤功效在治疗其它恶性肿瘤中也渐渐发挥出来。然而,近年来研究发现硼替佐米对免疫细胞如T细胞和树突细胞也有一定的毒性作用,如诱导活化的T细胞凋亡,抑制树突细胞活化T细胞的功能。自然杀伤(natural killer, NK)细胞是先天免疫细胞,在抗感染和抗肿瘤免疫中起着致关重要的作用。目前有关硼替佐米对NK细胞功能调节作用方面的研究甚少。目的研究蛋白酶体抑制剂硼替佐米对正常人外周血NK细胞功能的影响。方法硼替佐米对人外周血自然杀伤细胞功能的影响：采用淋巴细胞分离液分离正常人外周血单个核细胞,去除贴壁细胞后获取悬浮细胞即外周血淋巴细胞(PBLs)。体外应用白介素-2(IL-2)活化PBLs 48h产生淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞,将LAK细胞进行体外培养,给予不同浓度的硼替佐米处理6 h,CD56和CD3标记NK细胞(CD56+CD3-),肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)抗体联合标记进行流式细胞仪检测NK细胞群膜表面TRAIL的表达情况；和CD107a抗体联合标记检测硼替佐米对NK细胞脱颗粒的影响；细胞内染色法检测穿孔素的表达。采用NK细胞阴性选择试剂盒分离纯化正常人外周血NK细胞,流式细胞仪技术检测NK纯度,将NK细胞进行体外IL-2刺激,48h后给予不同浓度的硼替佐米或应用Bay-11 (NF-kB阻断剂)处理6h,应用TRAIL抗体标记进行流式细胞技术检测细胞膜表面TRAIL变化；采用经典的4h或改良的12h 51Cr释放试验测NK细胞的细胞毒作用或杀伤功能,分别以白血病细胞株K562细胞,骨髓瘤细胞株RPMI8226和U266细胞作为靶细胞。结果1)硼替佐米降低NK细胞膜表面TRAIL的表达。硼替佐米6h处理不影响活化的NK细胞的活性,但显著的降低NK细胞膜表面TRAIL的表达,其抑制TRAIL表达的作用与硼替佐米剂量呈正相关.2)硼替佐米可能通过NF-κB机制影响TRAIL的表达。此研究中所用NK细胞的纯度均在90%以上。4 nm,8nm和16nm硼替佐米或NF-kB阻断剂处理活化48h的NK细胞6h后,NK细胞表达的TRAIL在蛋白水平和mRNA水平呈剂量依赖关系下降(P<0.05),揭示硼替佐米通过阻断NF-κB通路下调TRAIL的表达。3)硼替佐米不影响NK细胞内穿孔素水平及NK细胞脱颗粒的功能。细胞内染色的研究结果显示：对照组与硼替佐米处理组NK细胞内穿孔素的表达水平无明显差异,并发现硼替佐米对NK细胞的脱颗粒功能无显著影响。4)硼替佐米影响NK细胞非胞吐或穿孔素介导的杀伤机制。为了研究硼替佐米对NK细胞非穿孔素或死亡受体机制介导的杀伤功能的影响,我们采用改良的51Cr释放试验(12h)检测NK细胞细胞毒功能。结果显示：低浓度硼替佐米(8nm)处理LAK细胞6小时后, NK细胞对K562细胞的杀伤作用在4h时无显著变化。当穿孔素细胞毒通路被预先阻断后12h 51Cr释放试验结果显示NK细胞杀伤K562,RPMI8226和U266的作用明显降低,与对照组比较,在效靶比20：1和10：1时,硼替佐米处理的NK细胞杀伤功能显著降低(p<0.02,p<0.005)。当用抗TRAIL抗体封闭NK细胞膜表达的TRAIL后,NK细胞杀伤RPMI8226细胞的能力基本被阻断,提示硼替佐米可影响TRAIL的表达以及TRAIL介导的杀伤瘤细胞的功能。结论硼替佐米通过阻断NF-κB通路抑制活化后的NK细胞表面TRAIL的表达,并抑制TRAIL活化途径或其它死亡受体机制所介导的NK细胞杀伤瘤细胞的功能

全文目录


摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
主要英文缩略语  10-11
第一章 绪论  11-23
  1.1. 前言  11
  1.2. 泛素-蛋白酶体概述  11-17
  1.3. 硼替佐米的研究现状  17-18
  1.4. 免疫系统概述及蛋白酶体抑制剂对免疫系统的影响  18-22
  1.5. 本文研究目的  22-23
第二章 蛋白酶体抑制剂对自然杀伤细胞功能影响的研究  23-37
  2.1. 材料  23-25
  2.2. 方法  25-29
  2.3. 统计分析  29
  2.4. 结果  29-34
  2.5. 讨论  34-36
  2.6. 结论  36-37
参考文献  37-44
攻读硕士学位期间发表的学术论文目录  44-45
致谢  45-46
学位论文评阅及答辩情况表  46

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药理学 > 实验药理学
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