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米非司酮影响女性分泌期外周血自然杀伤细胞杀伤活性及其表面受体CD94/NKG2A、NKG2D

作　者: 陈绣瑛
导　师: 黄丽丽
学　校: 浙江大学
专　业: 妇产科学
关键词: 米非司酮外周血 NK细胞分泌期细胞毒活性 CD94/NKG2A NKG2D
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 73次
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内容摘要

研究背景:胎儿作为一种半同种异体移植物,需要逃避母体的免疫攻击,才能成功着床。胚胎植入和发育的过程中,胚胎与母体局部免疫作用主要是胎儿滋养细胞和母体子宫蜕膜中的局部免疫细胞的相互作用。胚胎与母体全身免疫作用主要是胚胎的绒毛外合体滋养细胞和母体循环免疫细胞的相互作用。Sergeant等研究发现,胎儿和母体间的免疫作用主要是通过NK细胞而不是T细胞介导的。NK细胞是CD3-CD56+和/或CD16+的细胞。外周血自然杀伤细胞(pbNK)是一群重要的免疫细胞,占外周血淋巴细胞的5-15%,是一类不需要抗原刺激和抗体参与即能发挥杀伤作用的非T非B类淋巴细胞。研究发现,不明原因复发流产(recurrent spontaneous abortion,RSA)妇女的外周血NK细胞(pbNK)在数量和活性较正常育龄妇女有明显的变化,且在小鼠研究中发现,pbNK细胞活性的增高对胚胎发育有毒害作用,并推测pbNK细胞在人正常妊娠中起重要作用。NK细胞识别正常细胞和病毒感染或肿瘤细胞是通过其表面表达的一系列抑制性受体和活化性受体。NK细胞表面的受体决定了NK细胞的活性、增殖、效应功能,且在正常情况下,抑制性受体的信号传导占优势。CD94/NKG2A是一个稳定的蛋白,表达在大多数NK细胞表面像是故障保险性failsafe抑制性受体,其配体HLA-E几乎表达在所有细胞上。CD94/NKG2A通过抑制Vav1和ezrin-radixin-moesin(ERM)的磷酸化,传导抑制性信号,抑制NK细胞的杀伤活性。NK细胞对肿瘤细胞的杀伤主要是通过NCR和/或NKG2D,而胚胎逃避母体的免疫攻击在母体子宫内膜着床的机制类似于肿瘤细胞和病毒感染人体。而NK细胞表面重要的活化性受体之一NKG2D通过与CD94/NKG2A相反的机制,即通过诱导Vav1和ERM的磷酸化使NK细胞活化。在体外用NKG2D特异性单克隆抗体封闭NK细胞后,NK细胞对靶细胞的杀伤活性会降低,说明NKG2D是NK细胞重要的活化性受体。在肿瘤患者的研究中发现,肿瘤患者外周血NK细胞水平及NK细胞表面受体CD94/NKG2A和NKG2D较正常人明显增高,他们认为肿瘤能逃避机体的免疫攻击可能是由于外周血NK细胞表面受体CD94/NKG2A和NKG2D表达的不平衡引起的。米非司酮(mifepristone,RU486),是一种炔诺酮衍生物,与孕酮受体具有极强的亲和力,可竞争性抑制孕激素的作用,并具有抑制雌激素依赖性组织增生的作用。米非司酮最初是作为一种流产药物出现,近来米非司酮应用于紧急避孕,且剂量逐渐降低。研究发现,每日低剂量米非司酮抑制子宫内膜的发育而达到避孕的效果,是一种“内膜避孕药”。许多研究表明米非司酮对机体的免疫系统有明显作用,可以抑制正常淋巴细胞的增殖。低剂量米非司酮能增加植入窗期uNK细胞数量;且我们先前的研究发现低剂量米非司酮能够增加容受性子宫内膜CD56(+)NK细胞数,上调CD3(-)CD56(+)CD16(-)NK细胞亚群比例从而发挥对内膜免疫微环境的调控,这提示米非司酮可以通过对机体免疫系统的调节来影响胚胎植入。胚胎植入和发育的过程中,母体全身免疫微环境主要是通过pbNK和胚胎的绒毛外合体滋养细胞的相互作用而保护胚胎发育。因此,胚胎在植入过程中与外周血NK细胞的相互作用,直接影响着妊娠结局。然而米非司酮对pbNK细胞杀伤活性及其表面受体的影响还不清楚。本研究利用体外培养系统,应用流式细胞分析(FCM)技术和四甲基偶氮唑盐(MTT)技术,通过观察月经周期和避孕药物米非司酮对外周血NK细胞表面受体CD94/NKG2A和NKG2D的表达和外周血NK细胞活性的影响,以探讨米非司酮作为避孕药物的免疫学作用机制。材料与方法:研究对象为20名健康育龄妇女自愿者。入选妇女月经史、生殖系统解剖、内分泌等指标均正常,近3个月内无激素类药物使用史,其中10名于月经周期第19至24天取分泌期外周血,另外10名于月经周期第7-10天取增殖期外周血。其中收集的5ml增殖期外周血直接用于实验分析。收集的5ml分泌期外周血部分用于直接检测,剩余部分离心分离单核细胞后分成三等份,进行单核细胞培养,并给予不同浓度的米非司酮处理(分别为对照组、200nmol/L米非司酮组、1800nmol/L米非司酮组),然后进行实验分析。实验分析方法包括MTT实验法,检测人pbNK细胞杀伤活性;FCM分析法,检测外周血NK细胞表面受体CD94/NKG2A和NKG2D表达水平。结果:1.正常月经周期pbNK细胞活性及受体NKG2A、NKG2D表达水平的变化两组pbNK细胞杀伤活性(%)分别为:增殖期组(81.7±11.5)%,分泌期组(60.1±19.2)%,两组pbNK细胞杀伤活性有显著差异(P=0.007);分泌期外周血NK细胞表面抑制性受体CD94/NKG2A表达量为(60.15±30.92)%明显低于增殖期的表达量(86.62±9.04)%,两组间差异有统计学意义,P为＜0.05(0.018);而活化性受体NKG2D的表达量在分泌期(3.61±3.62)%和增殖期(8.73±8.27)%差异无显著性。2.米非司酮对体外培养分泌期外周血NK细胞活性变化MTT检测二种剂量(200、1800nmol/l)米非司酮作用后外周血NK细胞活性(%)分别为:37.9±33.0(对照组),51.7±26.0(200nmol/L米非司酮组),55.1±37.5(1800nmol/L米非司酮组),三组pbNK细胞杀伤活性有显著差异(P=0.003);两实验组分别与对照组相比,均显著增高(P＜0.05);两实验组之间无显著差异(P＞0.05)。3.米非司酮对体外培养分泌期外周血NK细胞表面受体表达的影响三种剂量米非司酮作用24小时后,分泌期外周血NK细胞表面抑制性受体CD94/NKG2A表达率(%)分别为:50.7±16.4(对照组),55.2±16.0(200nmol/L组),49.6±17.7(1800nmol/L组)。200nmol/L组与对照组、1800nmol/L组相比,显著增高(P＜0.05);对照组和1800nmol/L组之间无显著差异(P＞0.05)。米非司酮对外周血分泌期NK细胞表面的活化性受体NKG2D表达率(%)分别为:1.3±2.2(对照组)、1.4±1.4(200nmol/L组)、(1800nmol/L组)3.0±6.0,两两间差异无统计学意义(P＞0.05)。结论:1.米非司酮能增加分泌期pbNK细胞杀伤活性,提示米非司酮改变人分泌期全身免疫微环境的平衡而起避孕作用。2.米非司酮的增加pbNK细胞活性的作用可能不是经调节pbNK细胞表面受体CD94/NKG2A和NKG2D的途径。3.分泌期外周血NK细胞活性降低和NK细胞表面受体CD94/NKG2A和NKG2D的表达降低可能有利于胚胎着床。

全文目录

致谢  4-5
中文摘要  5-9
英文摘要  9-14
缩略词索引表  14-16
正文  16-36
  引言  16-20
  材料与方法  20-23
  结果  23-26
  讨论  26-30
  结论  30-31
  参考文献  31-36
综述  36-63
作者简历及在读期间发表文章  63-64
发表的文章  64-69

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