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采用SDSL-EPR技术研究LSECtin CRD结构域的运动性及构象特征

作　者: 周宇
导　师: 陈章宝；王长振；唐丽
学　校: 西南大学
专　业: 生化与分子生物学
关键词: LSECtin CRD结构域 SDSL-EPR 运动性构象
分类号: Q7
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

C型凝集素在体内参与细胞间的黏附和病原体、受体的识别,在固有免疫和适应免疫中发挥重要作用。该家族含有一个相似的主要功能结构域-糖基识别结构域(carbohydrate-recognition domains,CRDs),在Ca2+存在下能够结合糖链。军事医学科学院刘万里博士等率先在国际上克隆、鉴定了该家族一新成员LSECtin[1],系肝脏及淋巴结窦内皮细胞C型凝集素(liver and lymph node sinusoidal endothelial cell C-type lectin, LSECtin),为II型跨膜糖蛋白。人的LSECtin (hLSECtin) cDNA全长1411bp,编码293个氨基酸,与已知的C-型凝集素DC-SIGN、DC-SIGNR和CD23紧密成簇排列于染色体19p13.3区域,与其同家族成员DC-SIGN及DC-SIGNR分别有32%和31%的氨基酸序列同源性,并具有相似的功能结构域和相似的空间结构排列,同属于Ⅱ型C-型凝集素家族。目前相关LSECtin的研究已引起许多国际同行的关注：结果发现LSECtin能够Ca2+依赖性结合甘露糖、N-乙酰葡萄糖胺以及岩藻糖,但不结合半乳糖；LSECtin能在Kuffer细胞中表达并被PU.1调节：LSECtin能够结合纤丝病毒(filovirus)的糖蛋白以及SARS冠状病毒的s蛋白,N联糖基化并且不识别甘露聚糖，也能结合Ebola病毒表面的糖蛋白,能够通过骨髓细胞介导与病原体结合;LSECtin能够通过膜外区与DC-SIGNR和CD81这两个丙型肝炎病毒(HCV)受体相互作用,可能参与HCV与肝窦内皮细胞的结合；最新研究还发现LSECtin参与肝脏T细胞的免疫负调控,有关LSECtin的功能研究已经较为系统,但是其结构构象研究仍为空白。结构是功能的重要基础,因此对于CRD构象运动性的研究对于深入开展LSECtin的功能机制研究具有重要的价值和意义。位置定向自旋标记电子顺磁共振技术(SDSL-EPR)已经成为检测溶液中蛋白质构象的有力工具,目前SDSL正经历快速发展的应用阶段。SDSL技术是指在蛋白质或肽链的特定位点引入半胱氨酸残基,并用巯基特异的自旋标记物共价标记,此自旋标记物含有稳定的未配对电子,是一氮氧自由基分子,可作为EPR检测的探针。最常用的自旋标记物是甲硫代磺酸(MTSL), MTSL与半胱氨酸巯基特异地共价结合,将氮氧自由基定向掺入蛋白质。SDSL-EPR能提供大而复杂的蛋白质结构中单个残基的微环境及定位的特定信息。采用SDSL-EPR技术可以得到三类信息[8]：运动性,构象和距离。该方法对蛋白分子的大小没有限制,样品量可以很少,有时50-100皮摩尔即可。所有这些特点使得SDSL可以在蛋白质结构和动力学研究中得到广泛应用。本实验研究目的：建立采用位置定向自旋标记-电子顺磁共振(SDSL-EPR)技术研究蛋白质结构的方法,获得LSECtin的CRD的构象运动性的信息。方法：通过SOE-PCR法对LSECtin的CRD区引入Cys点突变,构建pET-28a-hLSECtin CRD表达载体,表达纯化野生型CRD结构域蛋白以及突变体蛋白,复性并进行活性测定,之后用MTSL定向标记,在CRD结构域蛋白中掺入氮氧自由基侧链,经EPR检测与解析,探索CRD结构域在溶液条件下的结构及运动性特点。结果：成功构建了野生型pET-28a-hLSECtin CRD表达载体以及6个突变体,并建立了大量表达蛋白的原核表达体系以及Ni-NTA agarose beads亲和纯化体系,采用DEAE离子交换层析柱的方法成功复性野生型与部分突变体CRD蛋白,MTSL标记后进行了初步的EPR检测,得到LSECtin的CRD的构象及运动性的简单信息。结论：MTSL能够有效地对设计的突变体蛋白的Cys标记,标记蛋白后的MTSL运动性受限。加入钙离子和单糖后旋转相关时间(τc)降低,运动性加快(F：G259C),说明CRD蛋白与配基结合后运动性发生了变化,可进一步研究与配体结合前后的构象变化。通过对易趋性的检测,结果显示,A标记位点(A：V264C)位于CRD的表面。本研究作为对C型凝集素LSECtin的CRD构象的初步探索,为以后研究该结构域与糖链及病毒蛋白结合时的构象改变,推测其配体结合功能奠定了基础。下一步可以研究该家族不同成员DC-SIGN、DC-SIGNR以及CD23之间不同CRD结构域的构象差异,探讨CRD功能差异以及与不同配体结合后的构象改变,为深入了解该家族蛋白的进化及其在免疫系统中的作用提供新的思路,也为相关疾病的预防与治疗提供小分子药物设计的靶标。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-9
第1章文献综述  9-17
  1.1 位置定向自旋标记(SDSL)电子顺磁共振(EPR)技术方法  10
  1.2 SDSL-EPR在蛋白质结构研究中的具体应用  10-12
  1.3 C型凝集素家族的发现及CRD在其术语界定中的作用  12
  1.4 CRD的结构研究进展  12-14
  1.5 CRD的Ca~(2+)结合位点  14-15
  1.6 CRD与配体的结合  15-16
  1.7 展望  16-17
第2章绪论  17-19
  2.1 研究目的和意义  17-18
  2.2 研究范围和内容  18-19
第3章 LSECtin的CRD结构域蛋白及其突变体的表达纯化与复性及活性检测  19-32
  3.1 SOE-PCR法向LSECtin基因的CRD结构域中引入Cys点突变  19-24
  3.2 构建pET-28a-hLSECtin CRD表达载体  24-26
  3.3 CRD结构域点突变体的表达纯化  26-29
  3.4 CRD结构域蛋白复性及活性测定  29-31
  3.5 本章小结  31-32
第4章 SDSL-EPR初步检测LSECtin的CRD结构  32-35
  4.1 材料  32
  4.2 方法  32-33
  4.3 结果及分析  33-34
  4.4 本章小结  34-35
第5章总结  35-36
附录  36-37
论文的创新点  37-38
参考文献  38-44
致谢  44-45
攻读学位期间发表的论文及参加的课题  45

采用SDSL-EPR技术研究LSECtin CRD结构域的运动性及构象特征

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