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结合MOG35-55抗原肽的I-A~b/FC二聚体的构建、表达与鉴定

作　者: 段红霞
导　师: 吴雄文
学　校: 华中科技大学
专　业: 免疫学
关键词: 抗原肽MOG35-55 MOG-I-A~b/Fc二聚体杆状病毒双表达系统构象完整
分类号: R744
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是几类自身免疫性疾病多发性硬化症（Ms）的动物模型，以中枢神经系统的炎症、脱髓鞘和轴突损伤为特征[1]。髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）为少突胶质细胞表面外层的膜蛋白，具有很强的抗原性，是引起脱髓鞘的主要免疫靶点[2]。其中35．55位氦基酸组成的抗原肽MOG35．55可在c57B『』/6小鼠体内诱导MOG35-55/I-A^b特异性自身反应性cD4-T细胞异常活化，诱发EAE[3]。抗原肽/MHc II复合物（pMHc）二聚体是由MHc II类分子共价结合一个特异性抗原肽并与免疫球蛋白IgG Fc段重组而成；通过IgGFc段的链间二硫键作用可形成MHcII类分子二聚体，能与TcR高亲和力结合，从而可用于检测或调节抗原特异性T细胞的研究[4，5]。MHcII类分子是由链、p链非共价结合而成的异二聚体，由于其结构的复杂性，体外表达存在较大的困能。本研究拟利用杆状病毒双表达系统，通过抗原肽MOG35-55与I-A^b链N端共价连接促进真核表达的I-A^b正确折叠，并引入亮氦酸拉链结构及IgG的F段构建MOG-I-A^b/Fc二聚体，以期获得正确构象的MOG-I-A^b/Fc二聚体，为研究MOG35-55诱导EAE的机制与干预手段提供物质基础。本研究的主要内容及结果如下：1．pFastBaTMDual+[MoG35—55一I—A^b/Fc]真核表达载体的构建利用相应的引物通过RT-PcR获得所有目的片段cDNA；通过重组PcR技术获得共价连接抗原肽MOG35-55的融合基因；利用基因重组技术，将I-A^b-Fos与IgGFcY2b顺序连入双表达载体pFaStBacTMDua1的Ph启动子下游，将MOG35-55--Jun连入PFaStBacTMDua1的PIO启动子下游，获得pFastBac^TMDual+[MOG35-55-I-A^b/Fc]重组质粒；经测序比对显示无有义突变，显示真核表达载体构建成功。2．MOG^A b/Fc融合蛋白的表达及鉴定按照bac-to-bac昆虫表达系统操作说明，将pFastBacTMDual+[MOG-I-A^b/Fc]重组质粒转化大肠杆菌DHl0TM E coli，获得重组Bacmid杆粒；利用Cellfection2000脂质体将该重组杆粒转染sf9昆虫细胞；重组杆粒经表达装配形成含MOG-I-A^b/Fc基因的重组杆状病毒：收集重组杆状病毒，进一步感染sf9细胞；收集感染后细胞上清，该上清即含有MOG-I-A^b/Fc二聚体融合蛋白；利用SPA柱对融合蛋白进行亲和层忻浓缩纯化，经ELISA、SDS-PAGE、Western blot及流式细胞术检测，显示重组蛋白能在昆虫细胞sf9中正确表达且具有生物学构象。

全文目录

英文缩略词表  5-6
中文摘要  6-8
Abstract  8-10
前言  10-13
第一部分  13-32
  材料与方法  13-25
  结果  25-28
  讨论  28-32
第二部分  32-55
  材料与方法  32-47
  结果  47-51
  讨论  51-55
小结  55-56
参考文献  56-58
综述  58-70
  参考文献  66-70
致谢  70

结合MOG35-55抗原肽的I-A~b/FC二聚体的构建、表达与鉴定

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