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狂犬病病毒CTN181株糖蛋白的真核表达及初步应用

作　者: 焦洋
导　师: 唐青
学　校: 中国疾病预防控制中心
专　业: 病原生物学
关键词: 狂犬病病毒 狂犬病毒 疾病预防 中和抗体 预防控制 控制中心 病毒病 重组杆状病毒 硕士学位论文 表达质粒
分类号: R373
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies Virus,RV)引起的一种烈性传染病,目前尚无有效的治疗手段,病死率几乎为100%,而接种狂犬疫苗是唯一有效的预防措施。评价狂犬疫苗效果的途径是检测免疫后血清中和抗体水平,目前主要是利用小鼠中和试验和细胞中和实验来检测,但这种方法操作较为复杂,不宜推广。狂犬病病毒糖蛋白(Glycoprotein,GP)是5种病毒蛋白中唯一能刺激机体产生中和抗体的抗原,所以狂犬病病毒GP在疫苗研制、抗体检测等方面有广泛的应用。除此之外,狂犬病病毒GP还与病毒毒力、致病性及病毒滴度等密切相关,本研究通过杆状病毒表达系统所表达的狂犬病病毒GP以及所建立的稳定表达狂犬病病毒GP的细胞系,不仅有助于探索更为安全易行的狂犬病抗体检测方法,还可为进一步研究狂犬病病毒GP结构和功能奠定基础。由于狂犬病病毒GP的已知抗原位点主要位于膜外区,本研究首先利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统分别表达狂犬病病毒GP及狂犬病病毒GP膜外区,利用重组表达的狂犬病病毒GP及狂犬病病毒GP膜外区蛋白做抗原,探索建立间接ELISA法检测人免疫后血清抗狂犬病病毒GP IgG水平。首先利用RT-PCR方法扩增得到狂犬病病毒CTN-181株GP基因编码区段和GP基因膜外区编码区段,然后利用杆状病毒表达系统将两段编码基因在昆虫细胞Sf9中进行表达。结果显示:克隆有G基因编码区段的重组杆状病毒表达质粒转染Sf9细胞后24小时出现细胞病变,48小时细胞病变明显;而在转染克隆有GP基因膜外区段的重组杆状病毒表达质粒转染Sf9细胞36小时后出现细胞病变,60小时细胞病变明显;间接免疫荧光及Western Blot结果显示表达的这两种蛋白均具有抗原性,并且完整GP的抗原性要优于GP膜外区的抗原性。进一步分别利用表达的GP及其膜外区做抗原,初步探索建立ELISA检测方法,检测人免疫后血清中抗GP IgG水平。结果显示,HRP标记的抗人IgG最佳稀释度为1:60000,通过棋盘滴定的方法获得了包被抗原的最佳稀释度为1:320,待测血清的最佳稀释度为1:100。在设定的实验条件下,GP膜外区做抗原用于ELISA检测方法(P/N值4.15:)优于以完整的GP做抗原(P/N值:3.12),但是存在的问题是背景值偏高,仍需进一步优化。本研究进一步利用IRES(内部核糖体进入位点)介导的双表达载体pIRES2-ZsGreen1,分别将CTN-181株G基因、增强型绿色荧光蛋白(ZsGreen)基因插入,构建可以同时表达狂犬病病毒CTN-181株G基因及增强型绿色荧光蛋白(ZsGreen)基因的双表达重组质粒,通过脂质体转染BHK-21细胞后,用新霉素类似物G418进行细胞株的筛选,建立稳定表达狂犬病病毒GP及ZsGreen的细胞系。结果所获得的细胞株可以高效并同时表达狂犬病病毒GP和ZsGreen,稳定进行细胞传代21代次,狂犬病病毒CTN-181 GP和ZsGreen两个蛋白仍可在已经获得的细胞系中稳定表达,所获得的细胞株ZsGreen检测阳性率在80%左右,生长周期为6天左右。该细胞系可以应用于狂犬病病毒GP抗体检测,也可以应用于建立狂犬病病毒反向遗传系统反式提供狂犬病病毒GP以期提高重组病毒滴度。狂犬病病毒GP及GP膜外区在杆状病毒中的成功表达以及表达狂犬病病毒GP及绿色荧光蛋白ZsGreen细胞系的建立为狂犬病特异性抗体的检测和评价奠定了基础,也为优化已有的狂犬病病毒反向遗传系统提供了新的科研思路和技术路线。

全文目录


中文摘要  7-9
英文摘要  9-12
前言  12-14
第一部分 狂犬病病毒CTN-181株糖蛋白的杆状病毒表达及初步应用  14-48
  材料和方法  15-31
    1 CTN-181株G基因的克隆  17-21
      1.1 引物设计  17-18
      1.2 RNA的提取  18-19
      1.3 RT-PCR  19
      1.4 CTN-181 G基因的克隆和鉴定  19-21
    2 CTN-181株G基因重组杆状病毒表达质粒的构建  21-25
      2.1 CTN-181 G基因重组转移质粒的构建  22-24
      2.2 CTN-181 G基因重组表达质粒的构建  24-25
    3 CTN-181株G蛋白的表达及鉴定  25-28
      3.1 G基因重组表达质粒大量制备  25-26
      3.2 G基因重组表达质粒脂质体转染sf9细胞  26
      3.3 转染细胞病变观察  26-27
      3.4 G基因重组杆状病毒的扩增  27
      3.5 杆状病毒表达G蛋白的鉴定  27-28
        3.5.1 PCR鉴定  27
        3.5.2 间接免疫荧光鉴定  27-28
        3.5.3 Western-Blot鉴定  28
    4 表达的G蛋白初步应用  28-31
      4.1 HRP标记的抗人IgG抗体稀释度的优化  29
      4.2 间接ELISA法的初步探索  29-30
      4.3 间接ELISA法的初步应用  30-31
  结果  31-43
    1 CTN-181株G蛋白基因的克隆和鉴定  31-33
      1.1 CTN-181 G基因的扩增  31
      1.2 CTN-181 G基因T-A克隆重组质粒的构建和鉴定  31-33
    2 CTN-181株G基因重组杆状病毒表达质粒的构建和鉴定  33-35
      2.1 CTN-181 G基因转移质粒的构建和鉴定  33-34
      2.2 CTN-181 G基因表达质粒的构建和鉴定  34-35
    3 重组CTN-181株G蛋白的表达及鉴定  35-39
      3.1 重组表达质粒转染Sf9细胞后病变效应(CPE)的观察  35-37
      3.2 杆状病毒表达G蛋白的鉴定  37-39
        3.2.1 PCR鉴定  37
        3.2.2 间接免疫荧光鉴定  37-38
        3.2.3 Western-Blot鉴定  38-39
    4 表达G蛋白在的初步应用  39-43
      4.1 HRP标记的抗人IgG抗体稀释度的优化  39-40
      4.2 间接ELISA法的初步探索  40-42
      4.3 间接ELISA法的初步应用  42-43
  讨论  43-47
  小结  47-48
第二部分 表达狂犬病病毒CTN-181株糖蛋白细胞株的建立  48-67
  材料和方法  49-58
    1.狂犬病病毒CTN-181株G基因pIRES2-ZsGreen1和pIRES2-AcGFP1-Nuc表达质粒的构建  50-55
      1.1 CTN-181株G基因克隆入pcDNA3.1(+)载体  50-52
      1.2 CTN-181 G基因+pIRES2-ZsGreen1和CTN-181 G基因+pIRES2-AcGFP1-Nuc表达质粒的构建  52-55
    2.表达狂犬病病毒CTN-181 G蛋白细胞系的建立  55-58
      2.1 BHK-21细胞最适G418筛选浓度的确定  55
      2.2 狂犬病病毒CTN-181株G基因pIRES2-ZsGreen1和plRES2-AcGFP1-Nuc重组表达质粒的大量制备  55
      2.3 CTN-181 G基因表达质粒转染BHK-21细胞  55-56
      2.4 表达CTN-181 G蛋白的细胞系的筛选  56
      2.5 表达CTN-181 G蛋白的细胞系的鉴定  56-58
        2.5.1 荧光鉴定  56
        2.5.2 PCR鉴定  56-58
  结果  58-64
    1.狂犬病病毒CTN-181株G基因pIRES2-ZsGreen1和pIRES2-AcGFP1-Nuc重组表达质粒的构建和鉴定  58-60
      1.1 CTN-181株G基因+pcDNA3.1(+)表达质粒的构建和鉴定  58-59
      1.2 CTN-181 G基因+pIRES2-ZsGreen1和CTN-181 G基因+pIRES2-AcGFP1-Nuc表达质粒的构建和鉴定  59-60
    2.表达狂犬病病毒CTN-181 G蛋白细胞系的建立  60-64
      2.1 BHK-21细胞最适G418筛选浓度的确定  60-61
      2.2 表达CTN-181 G蛋白细胞系的鉴定  61-64
        2.2.1 荧光鉴定  62
        2.2.2 PCR鉴定  62-64
  讨论  64-66
  小结  66-67
论文总结  67-68
综述:狂犬病病毒糖蛋白的性质及其应用  68-76
论文参考文献  76-82
英文缩略语表  82-83
个人简历  83-84
致谢  84-85
附录  85-103

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学） > 人体病毒学（致病病毒）
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