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黄孢原毛平革菌T-DNA插入突变体系构建研究

作　者: 薛仁军
导　师: 宋安东
学　校: 河南农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 生物预处理 AMT 黄孢原毛平革菌 双元载体
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


秸秆高效利用中的一个重要瓶颈技术是预处理技术。秸秆的微生物处理目前被认为是最有前途的处理方法。鉴于秸秆的生物预处理技术还未成熟,仍存在着处理效率低,周期长等弱点,本研究旨在采用T-DNA随机插入突变的方法,试图对白腐真菌的模式菌种——黄孢原毛平革菌进行基因改造,进而获得改良的性状,最终服务于秸秆的高效生物预处理。利用基因工程原理,成功构建了双元载体,这种载体以pCAMBIA1300为骨架,把原有的T-DNA序列替换为完整的潮霉素B抗性基因,包括来自黄孢原毛平革菌的潮霉素抗性基因启动子,来自大肠杆菌的潮霉素抗性基因hyg以及来自黄孢原毛平革菌的lip6终止子,如将此T-DNA转入黄孢原毛平革菌基因组,理论上可以赋予黄孢原毛平革菌自身较高的潮霉素抗性。此抗性可作为T-DNA插入突变试验的筛选标记。通过不同方案将双元载体质粒向农杆菌转化,发现转化效率显著不同。使用液氮速冻的方法转化经CaCl2处理的感受态农杆菌,未出现转化子,改变液氮处理时间、质粒DNA的用量及受体菌种类等因素,均未获得转化子,表明速冻的方法向农杆菌引入质粒比较困难;借助于诱动质粒pRK2013,使用三亲结合的方法顺利将双元载体导入农杆菌,并且转化效率较高。至此,用于侵染黄孢原毛平革菌双元载体系统构建完成。对含上述双元载体系统的农杆菌侵染黄孢原毛平革菌进行了初步研究,通过调节真菌起始材料,共培养比例,诱导剂AS的使用浓度等因素,均未获得转化子。本试验过程中,因多次出现假阳性结果,双元载体系统的构建及鉴定耗去大量时间,致使后续的侵染试验时间不足,最佳侵染条件未能及时摸清,没能获得转化子。

全文目录


致谢  4-7
摘要  7-8
1 文献综述  8-22
  1.1 能源概述  8
  1.2 秸秆预处理技术  8-10
  1.3 生物预处理  10-13
    1.3.1 微生物降解秸秆的机理  10
    1.3.2 秸秆降解前后的变化  10-11
    1.3.3 影响微生物降解秸秆的因素及研究进展  11-13
  1.4 丝状真菌的改造  13-16
    1.4.1 丝状真菌的常规方案诱变  13-16
    1.4.2 丝状真菌的现代方案诱变  16
  1.5 白腐菌AMT 转化的研究进展  16-21
    1.5.1 农杆菌转化系统AMT  16-18
    1.5.2 影响因素  18-20
    1.5.3 AMT 应用于白腐菌的研究  20-21
  1.6.研究内容和技术路线  21-22
    1.6.1 研究目的及意义  21
    1.6.2 技术路线  21-22
2 引言  22-23
3 材料与方法  23-28
  3.1 菌种及质粒  23
  3.2 培养基和试剂  23-24
    3.2.1 培养基  23
    3.2.2 主要试剂  23-24
  3.3 试验方法  24-28
    3.3.1 双元载体构建及验证方案  24-25
    3.3.2 农杆菌液氮速冻转化方案  25-26
    3.3.3 农杆菌三亲接合转化方案  26
    3.3.4 头孢噻肟对农杆菌的最低抑制浓度  26
    3.3.5 分生孢子转化方案  26-27
    3.3.6 原生质体转化方案  27-28
4 结果与分析  28-40
  4.1 双元载体的构建结果  28-36
    4.1.1 出发质粒酶切鉴定  28-29
    4.1.2 pCAMBIA1300 双酶切及片段回收  29-32
    4.1.4 双元载体的酶连  32
    4.1.5 双元载体pC61300 单酶切及双酶切  32
    4.1.6 PCR 及测序验证  32-36
  4.2 双元载体向农杆菌的转化结果  36-38
    4.2.1 液氮速冻转化  36
    4.2.2 三亲接合转化  36
    4.2.3 农杆菌双元载体酶切验证  36-37
    4.2.4 PCR 验证  37-38
  4.3 农杆菌侵染黄孢菌试验结果  38-40
    4.3.1 农杆菌对头孢噻肟敏感性  38
    4.3.2 黄孢菌分生孢子形态观察  38-39
    4.3.3 原生质体检测  39-40
5 结论与讨论  40-42
  5.1 结论  40
    5.1.1 双元载体pC61300  40
    5.1.2 双元载体系统  40
  5.2 讨论  40-42
参考文献  42-47
Abstract  47

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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