学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示
磁分离靶蛋白—配体复合物快速筛选混合物配体库的技术
作 者: 谢燕玲
导 师: 廖飞
学 校: 重庆医科大学
专 业: 生物制药与生物医用材料
关键词: 混合物配体 靶蛋白 亲和力 组合库 高亲和力配体指数富集 磁分离 靶蛋白-配体复合物 色谱分析
分类号: Q503
类 型: 硕士论文
年 份: 2009年
下 载: 30次
引 用: 2次
阅 读: 论文下载
内容摘要
本论文提出一种基于磁分离靶蛋白-配体复合物快速筛选混合物配体库的技术,其过程包括(a)将混合物样品与适量外源参考配体混合作为用于筛选样品(PMFS);(b)启动PMFS中所有配体与固定在纳米磁珠上的靶蛋白竞争结合;(c)磁力回收靶蛋白-配体复合物,提取结合的配体;(d)定量PMFS和对应结合配体提取物中每个可检测配体色谱峰面积;(e)如所有必要条件都满足,则计算候选配体与参考配体的相对亲和力,否则需优化PMFS和/或竞争结合系统的组成直到满足所有必要条件;(f)确定每个混合物库成分中潜在有价值配体;(g)确定潜在有价值配体中的高亲和力配体为潜在hit(s);(h)通过竞争结合判断潜在hit(s)特异性以确认hit(s);否则确定其它潜在有价值配体的特异性。用HPLC-MS分析,以生物素衍生物与固定在纳米磁珠上链亲和素为模型,考察此技术用于测定平行液相组合合成(PLCS)单一预期配体混合物、PLCS制备多个预期配体混合物、粗天然产物中多个预期配体等亲和力的可靠性,及鉴定粗天然产物中痕量高亲和力配体的可行性。测定混合物中单一预期配体亲和力时,维持竞争结合体系参考配体结合率低于10%,逐步增加PMFSs中候选配体量则候选配体结合率逐步降低,同时两种配体的峰面积可大于各自线性响应截距绝对值的5倍,候选配体相对亲和力也逐步降低;当二者结合率都低于10%后相对亲和力达到下降曲线水平底部的均值可为该配体的相对亲和力。定量测定混合物中多个预期配体亲和力时,对纯化生物素衍生物的混合物和PLCS制备的多生物素衍生物混合物,只要其中所含候选配体数量足够少且含量差异足够小,在相同的实验条件下用HPLC-MS分析能成功筛选出多个混合物中最高亲和力的配体。对此两类样品,其组成决定此方法可靠性。通过与高亲和力参考配体竞争结合和同变性靶蛋白结合,可有效同步判断混合物中多个候选配体的特异性。如粗天然产物中候选生物素衍生物间含量差异较小,此技术也可同步测定其中有限数量候选配体的亲和力和同步判断其特异性。以前一轮回收的配体为样品进行下一轮的筛选,通过竞争结合、磁分离后提取结合配体等过程的迭代进行,理论上可实现混合物中高亲和力配体的指数富集(EELHA)。用含有多个不同亲和力和不同含量生物素衍生物的川芎甲醇提取液为样品,证实该策略有效富集高亲和力配体,从而快速发现混合物中含量仅2%但亲和力高三倍的配体。为提高EELHA的效果,相邻下轮筛选时靶蛋白量应不多于上一轮回收配体总量的20%,但此迭代过程对应的靶蛋白用量很大。EELHA对发现已知药理活性粗天然产物中的痕量高亲和力配体具有重要价值。因此,该筛选技术有望用于以混合物为库成分的配题库筛选,且EELHA对发现粗天然产物中的痕量高亲和力配体具有重要价值。
|
全文目录
英汉缩略语名词对照 6-7 中文摘要 7-9 英文摘要 9-13 前言 13-18 第一部分 测定混合物中配体亲和力的原理 18-23 1 此新策略的基本操作过程 18-19 2 测定混合物中配体亲和力的化学计量学原理 19-21 3 讨论 21-23 第二部分 生物素衍生物的制备和结构鉴定及其亲和力的分别测定 23-36 第一章 生物素衍生物的制备、纯化及结构鉴定 23-31 1 实验材料 23-24 2 实验方法 24-26 3 结果 26-31 4 讨论 31 第二章 荧光共振能量转移测定生物素衍生物亲和力 31-36 1 实验材料 31-32 2 实验方法 32-35 3 结果 35 4 讨论 35-36 第三部分 测定混合物中单一预期配体的亲和力 36-40 1 实验材料 36 2 实验方法 36-38 3 结果 38-39 4 讨论 39-40 第四部分 测定人工混合物中多个已知配体的亲和力 40-43 1 实验材料(见第三部分) 40 2 实验方法 40-41 3 结果 41-42 4 讨论 42-43 第五部分 测定液相组合合成混合物中多个预期配体的亲和力 43-48 1 实验材料 43 2 实验方法 43-45 3 结果 45-46 4 讨论 46-48 第六部分 测定天然产物混合物中多个已知配体的亲和力及高亲和力低丰度配体发现的特殊策略 48-52 1 实验材料 48 2 实验方法 48-50 3 结果 50-51 4 讨论 51-52 全文总结 52-53 附图 53-61 参考文献 61-65 致谢 65-66 硕士期间发表论文情况 66-67
|
相似论文
- 红外辅助提取技术在丹参等中药有效成分提取分析中的应用研究,R284.2
- 新型吸附材料的合成及其对痕量金属离子的富集分离研究,O658
- 哒嗪酮合成工艺的研究,TQ25
- 中缅树鼩UCP-1的分子生物学研究,Q959
- 食用酒中甲醇气相色谱分析方法研究,R313
- LHON家系线粒体DNA突变与发病和预后的关系,R774.6
- 磁性微胶囊的制备及其在酚类物质去除、检测方面的应用,X703
- 参麦注射液质量评价方法研究,R286.0
- 反应色谱测定方法的研究与应用,O657.7
- 甲基氯硅烷合成催化剂的研究,TQ426.9
- 直接法合成二甲基二氯硅烷的实验研究,O627.41
- 四川某制药厂废水的能源化利用与达标排放技术研究,X703
- 高效液相色谱芳基键合硅胶固定相的制备与评价,O657.72
- 2,4,5-三氟苯甲酸合成研究,TQ245.1
- 大鼠脑组织中去甲肾上腺素及肾上腺素浓度变化与尿毒症脑病的关系,R747.9
- 尿毒症脑病大鼠脑组织多巴胺、5-羟色胺含量变化及发病机制的探讨,R747.9
- 食品中有机氯杀虫剂分析方法研究,TS207.53
- 建立具有药物代谢酶CYP2C9活性的微生物模型,R965
- 鸡腿菇发酵条件及其胞外多糖的研究,S646.1
- 铜配合物与DNA的相互作用和电化学诱导DNA的切割,O641.4
中图分类: > 生物科学 > 生物化学 > 一般性问题 > 生物化学技术
© 2012 www.xueweilunwen.com
|