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茶枝柑皮多糖提取、分离纯化、结构及抗氧化活性研究
作 者: 陈思
导 师: 黄庆华
学 校: 广东药学院
专 业: 药物分析
关键词: 茶枝柑皮多糖 提取 纯化 柱前衍生高效液相色谱 结构分析 抗氧活性
分类号: R284.1
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
下 载: 189次
引 用: 1次
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内容摘要
茶枝柑皮是茶枝柑(Citrus reticulata‘Chachi’)的成熟果皮,果皮晒干陈化后,便成了广东道地药材——广陈皮。茶枝柑皮主要是药用(作为广陈皮)、制成调味品及凉果,除了含有挥发油、黄酮外,茶枝柑皮还含有丰富的果胶多糖,历来对茶枝柑皮未进行深加工,造成资源的浪费。本论文以茶枝柑皮为原料,利用现代分离分析手段,对茶枝柑皮果胶多糖的提取、纯化工艺、单糖组成的测定方法、化学结构及其体外抗氧化活性进行了较系统的研究,以期为茶枝柑资源的开发利用提供科学依据和利用途径。1.采用酸水提醇沉法提取茶枝柑皮粗多糖(CCP)。单因素试验确定各因素(提取溶剂pH值、料液比、提取温度和时间)对多糖得率和抗氧化能力影响的合适水平,并用正交试验进一步优化。经试验得出CCP的最佳提取工艺为:用pH4的酸水、料液比为1:30、提取温度90℃、提取时间90min,在此条件下多糖得率和抗氧化FRAP值分别为18.9%和48.9。粗提多糖膨胀力和持水力均较高,并属于高酯果胶多糖。2.将CCP通过树脂脱色和Sevag试剂去除蛋白,得到纯化的多糖CP。通过静态吸附法,考察了大孔吸附树脂、离子交换树脂对CCP溶液的脱色率,由于D-201阴离子交换树脂脱色效果优于其它树脂,故选择D-201树脂作为CCP的脱色树脂,并进一步研究了D-201树脂的最佳脱色工艺:脱色温度40℃,树脂用量8%(m/v),转速75r/min振荡2h。Sevag法除蛋白则需在反复萃取6~9次后,达到蛋白去除率为74%。3.采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)作为还原醛糖的标识分子,柱前衍生化高效液相色谱-紫外检测器(HPLC-UV)和普通C18柱,建立了8种常见单糖的快速分析鉴别技术,并且确定了单糖的衍生化条件及多糖CP的水解条件。CP用2 mol/L的三氟乙酸(TFA)在120℃烘箱中水解2h得到各单糖,单糖在70℃下与PMP衍生化反应40min后用1:1(v/v)氯仿涡旋萃取3次。流动相20%(v/v)乙腈-磷酸盐缓冲溶液(pH 7.1)、流速1.0 mL/min、等度洗脱即可实现单糖的良好分离。方法学考察结果表明,各单糖的相关系数、精密度、重复性、回收率均良好。4.对纯化后的茶枝柑皮多糖CP采用DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析进行分离得到4个组分,分别命名为CPN、CPA-1、CPA-2、CPA-3,将CPA-1、CPA-2、CPA-3进一步用Sephadex G-100凝胶排阻层析纯化得到对应的CPA-Ⅰ、CPA-Ⅱ、CPA-Ⅲ。经TSK G-5000 PWxL、TSK G-3000 PWxL柱高效凝胶色谱分析,证实CPA-Ⅰ、CPA-Ⅱ、CPA-Ⅲ具有较高的纯度,其重均分子量分别为8.0×104 Da、2.6×105Da、2.4×105Da。红外光谱结果表明,CPN是带有结晶水的吡喃多糖,CPA-Ⅰ、CPA-Ⅱ和CPA-Ⅲ均是部分羧酸甲酯化的α-半乳糖醛酸多聚糖。NMR结果推测茶枝柑皮多糖主链是由(1→4)-α-GalpA构成,存在部分半乳糖醛酸甲酯化,半乳糖、鼠李糖、甘露糖等以α-吡喃糖形式存在于末端或侧链。单糖组成分析表明,CPN中单糖的摩尔比是Man: Rha: GalA: Glc: Gal: Xyl: Ara =0.34: 0.07: 5.30:1:4.71:0.61:14.7;CPA-Ⅰ的单糖摩尔比是Man: Rib: Rha: GalA: Glc: Gal: Ara = 0.12: 0.04: 0.74: 39.33: 1: 8.48: 24.05;CPA-Ⅱ的单糖摩尔比是Man: Rib: Rha: GalA: Glc: Gal: Ara=0.94: 0.05: 1.33: 56.65: 1: 7.04: 19.38;CPA-Ⅲ的单糖摩尔比是Man: Rha: GalA: Glc: Gal: Ara=2.02: 1.98: 122.66: 1: 8.85: 26.26。5.通过体外模拟试验,采用MTT法首先筛选了H2O2致U251细胞损伤的最佳成模浓度,是0.1875mmol/L;再研究了茶枝柑皮粗多糖(CCP)对过氧化氢损伤的U251细胞的保护作用,在试验浓度2.500-0.078mg/mL范围内呈剂量依赖关系;CCP脱蛋白后的多糖则未表现出抗氧化活性。
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全文目录
摘要 7-9 Abstract 9-11 第1章 绪论 11-21 1. 糖类物质的定义、分类 11 2. 多糖的提取和纯化 11-14 2.1 多糖的提取 11-13 2.2 多糖的纯化 13-14 3. 多糖的单糖组成测定方法 14-18 3.1 单糖组成的气相色谱法 14-15 3.2 单糖组成的高效液相色谱法 15-18 4. 多糖化学结构表征方法 18-19 4.1 多糖结构的化学分析法 18-19 4.2 仪器分析法 19 5. 研究目的与主要研究内容 19-21 第2章 茶枝柑皮多糖提取工艺研究 21-33 1 材料与仪器 21-22 1.1 材料 21 1.2 仪器 21-22 2 方法 22-27 2.1 原料处理 22 2.2 茶枝柑皮多糖提取工艺流程 22-23 2.3 粗多糖中总糖含量测定 23-24 2.4 粗多糖体外总抗氧化能力的测定 24 2.5 粗多糖提取综合评分 24 2.6 多糖得率及抗氧化能力单因素试验 24-25 2.7 多糖得率及抗氧化能力的正交试验 25 2.8 验证试验 25-26 2.9 茶枝柑皮多糖的理化性质分析 26-27 3 结果与讨论 27-31 3.1 粗多糖体外总抗氧化能力的测定 27 3.2 各因素对多糖得率及抗氧化能力的影响 27-29 3.3 正交试验结果 29-30 3.4 苯酚‐硫酸法测定粗多糖中总糖含量 30 3.5 茶枝柑皮粗多糖的理化性质分析结果 30-31 4. 本章小结 31-33 第3章 茶枝柑皮多糖的纯化 33-42 1. 材料与仪器 33-34 1.1 材料 33 1.2 仪器 33-34 2 方法 34-37 2.1 树脂脱色 34-36 2.2 脱蛋白 36-37 3 结果与讨论 37-40 3.1 树脂筛选的结果 37-38 3.2 单因素试验结果 38-39 3.3 正交试验结果 39-40 3.4 验证试验结果 40 3.5 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量 40 4 本章小结 40-42 第4章 柱前衍生化HPLC 测定单糖组成分析方法的建立 42-54 1 材料与仪器 42-43 1.1 材料 42 1.2 仪器 42-43 2 方法与结果 43-53 2.1 溶液制备 43 2.2 色谱条件 43-44 2.3 方法学考察 44-48 2.4 多糖水解条件与单糖衍生化条件考察 48-51 2.5 色谱分离条件的优化 51-53 3. 本章小结 53-54 第5章 茶枝柑皮多糖的系统分级及结构初步研究 54-68 1 材料与仪器 54-55 1.1 材料 54-55 1.2 仪器 55 2 方法 55-58 2.1 茶枝柑皮多糖(CP)的离子交换柱层析 55-56 2.2 茶枝柑皮多糖CP 的凝胶柱层析 56-57 2.3 高效凝胶渗透色谱法测定分子量 57 2.4 紫外光谱扫描 57 2.5 红外光谱分析 57-58 2.6 核磁共振分析 58 2.7 单糖组成分析 58 3 结果与讨论 58-66 3.1 茶枝柑皮多糖离子交换层析 58-60 3.2 茶枝柑皮多糖组分的凝胶柱层析 60 3.3 单糖组成分析 60-61 3.4 茶枝柑皮多糖组分的紫外扫描光谱 61-62 3.5 红外光谱分析 62-64 3.6 高效凝胶渗透色谱 64-65 3.7 核磁共振 65-66 4. 本章小结 66-68 第6章 茶枝柑皮多糖抗氧化活性研究 68-74 1 材料与仪器 68-69 1.1 材料 68 1.2 仪器 68-69 2 方法 69-71 2.1 溶液配制 69 2.2 药物配制 69 2.3 U251 细胞培养 69 2.4 茶枝柑皮多糖、脱蛋白多糖对人神经胶质瘤细胞U251 损伤保护作用研究 69-70 2.5 统计分析 70-71 3. 结果与讨论 71-73 3.1 筛选H_20_2 最佳成模浓度 71-72 3.2 茶枝柑皮多糖对H_20_2 损伤的U251 细胞的保护作用 72-73 4 本章小结 73-74 第7章 结论与展望 74-76 参考文献 76-84 攻读学位期间发表的论文 84-85 附录 85-92 致谢 92
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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药化学 > 化学分析与鉴定
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