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副溶血性弧菌全基因组DNA芯片和比较基因组学研究

作　者: 韩海红
导　师: 刘秀梅；周冬生
学　校: 中国疾病预防控制中心
专　业: 营养与食品卫生学
关键词: 副溶血性弧菌 DNA芯片比较基因组学进化基因组学
分类号: R155.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 206次
引　用: 2次
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内容摘要

背景副溶血性弧菌是引起全球食物中毒的重要致病菌,1996后出现的由副溶血性弧菌引起的食物中毒爆发,可能是由‘大流行菌群’引起。同本学者在2003年完成了副溶血性弧菌大流行菌株RIMD2210633的全基因组序列的测定。本研究目的是通过基因芯片技术,针对大量具有代表性的全球性副溶血性弧菌菌株进行基于芯片的比较基因组学研究,以深入认识副溶血性弧菌基因组多态性和种群的系统发育。方法利用副溶血性弧菌全基因组序列,挑选出4770条基因,PCR扩增各基因并将PCR产物纯化,点样制备芯片。设计了两个质控杂交组合,采用双色荧光杂交策略,对芯片质量进行评价,并用PCR方法验证部分芯片结果。针对174株副溶血性弧菌,进行基于芯片的比较基因组学研究。用原核表达系统构建副溶血性弧菌几种重要毒力相关基因的表达载体。结果成功的研制了一批副溶血性弧菌全基因组DNA芯片。经质量评价,发现芯片杂交与理论预期结果以及PCR验证结果完全一致,证明此芯片质量良好,可以用于后续的比较基因组杂交。建立了基于DNA芯片的副溶血性弧菌比较基因组学技术平台,建立了一套系统的芯片数据分析的标准方法。成功构建了六种重要毒力相关基因的原核表达载体,为以后深入研究副溶血性弧菌致病机制打下物质基础。我们对174株菌的芯片数据进行了系统进化分析后,得到了174个菌株的种系结构图——最小生成树。174株菌被分为了5个群(C1至C5),每个群内的个体在种系发生和遗传学上彼此密切相关。C3和C4代表高毒的临床克隆株,而C5群和无毒的环境分离株高度相关。C2和C3分别组成了两个不同的克隆群——‘旧03:K6克隆群’和‘大流行菌群’。c3包括了所有经PCR验证为大流行菌株的39个菌株(trh~-,tdh~+和GS-PCR~+),C2则包括了12株1996前的旧03:K6菌株(trh~+,tdh和GS-PCR~-)。大流行菌群f,1996后‘新’03:K6和它的衍生菌株04:K68,O1:K25,01:KUT和06:K18)是由旧O3:K6克隆进化而来,进化过程包括toxRS/新序列的出现和基因组岛的逐步获得。研究还发现了介于大流行菌群和旧O3:K6克隆群之间的一个种系发育的‘中间型O3:K6进化枝’(trh~-,tdh~- and GS-PCR~+)。174株菌的差异组成的基因占全基因组总数的22%。结论通过大量菌株的基于芯片的比较基因组学研究,获得了这些菌株的基因组成概况、种群结构和大流行菌群的进化史。

全文目录

缩略词表  7-9
中文摘要  9-11
Abstract  11-13
前言  13-35
  一、副溶血性弧菌的毒力  13-18
    1 副溶血性弧菌已成为引发食物中毒的首要病原菌  13-14
    2 副溶血性弧菌的血清型及大流行菌群的出现  14
    3 副溶血性弧菌的毒力因子  14-18
  二、基因芯片的研究与应用  18-25
    1 基因芯片的技术基础  19-20
    2 基因芯片的制备及分类  20-21
    3 目标杂交和图像分析  21-22
    4 基因芯片和生物信息学  22
    5 基因芯片的应用  22-24
    6 基因芯片的展望  24-25
  三、本研究的目的与意义  25-26
  参考文献  26-35
第一章副溶血性弧菌全基因组DNA芯片的研制  35-47
  1 引言  35
  2 材料  35-36
    2.1 实验用菌株  35
    2.2 主要试剂  35-36
    2.3 主要材料和仪器  36
  3 方法  36-40
    3.1 芯片的研制  36-38
    3.2 芯片杂交  38-39
    3.3 PCR方法验证部分芯片结果  39-40
  4 结果和讨论  40-46
    4.1 芯片的研制  40-42
    4.2 芯片杂交  42
    4.3 芯片质量的评价  42-45
    4.4 副溶血性弧菌DNA芯片研制的意义  45-46
  参考文献  46-47
第二章副溶血性弧菌的基因组多态性和种群结构:‘大流行菌群’的进化史  47-78
  1 引言  47
  2 材料  47-48
    2.1 实验用菌株  47
    2.2 主要试剂  47-48
    2.3 主要材料和仪器  48
  3 方法  48-49
    3.1 模板的制备  48
    3.2 芯片研制、DNA标记、芯片杂交和芯片数据分析  48
    3.3 聚类和种系发生分析  48-49
    3.4 用PCR验证部分芯片结果和用PCR研究菌株的分子标识  49
  4 结果和讨论  49-75
    4.1 菌株收集  49
    4.2 引物的序列及PCR扩增条件  49-50
    4.3 菌株的基本特征  50-53
    4.4 种系发育结构  53-55
    4.5 大流行菌群的进化史  55-58
    4.6 差异存在基因的特点  58-61
    4.7 基因组岛的分布  61-62
    4.8 讨论  62-75
  参考文献  75-78
第三章副溶血性弧菌几种重要毒力相关蛋白的表达  78-84
  1 引言  78
  2 材料  78
    2.1 菌株和质粒  78
    2.2 主要试剂  78
    2.3 主要材料和仪器  78
  3 方法  78-81
    3.1 PCR模板的制备  78
    3.2 引物设计与合成  78-79
    3.3 目的基因的扩增  79-80
    3.4 质粒和扩增产物双酶切  80
    3.5 目的基因克隆入质粒DNA  80
    3.6 感受态细菌(BL21)制备  80
    3.7 连接产物转化感受态大肠杆菌BL21  80-81
    3.8 阳性克隆的挑选及目的蛋白的表达  81
    3.9 甘油保种  81
  4 结果和讨论  81-83
  参考文献  83-84
已发表文章  84-105
待发表文章  105-126
附录: 实验中用到的部分试剂/溶液配制方法  126-129
致谢  129-130

副溶血性弧菌全基因组DNA芯片和比较基因组学研究

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