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乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,严重威胁女性的身心健康。在许多国家,乳腺癌发病率呈升高趋势,是导致女性肿瘤患者死亡的第二大原因,患者多死于乳腺癌的复发或转移,而淋巴道转移是其最常见的转移途径,是判断乳腺癌分期、预后和选择治疗方案最重要的因素,往往成为评价乳腺癌患者预后和选择治疗方式的主要标准之一。癌细胞通过淋巴管或血管最终转移至区域淋巴结和远隔器官,而肿瘤淋巴管浸润和血管浸润的发生在淋巴结转移过程中扮演着重要角色。但是,长期以来人们并没有对乳腺癌的淋巴转移进行更深入的研究,其主要原因是因为找不到特异性较好的淋巴管内皮标记物来识别淋巴管,而肿瘤血管生成及浸润研究较多,大多学者认为其与淋巴结转移有明确相关。直到近几年,特异性较强的淋巴管标记物单克隆抗体D2-40的出现才使淋巴管的研究得到重视。目前以D2-40做为标记物的淋巴管相关研究还刚刚起步。本研究拟以D2-40和CD34分别标记淋巴管和血管,检测癌组织中淋巴管和血管受癌细胞浸润的情况,探讨淋巴管浸润和血管浸润的临床病理学特点以及其在乳腺癌淋巴转移过程中的意义,希望对乳腺癌临床分期及预后的评估有所助益。目的探讨以D2-40和CD34分别做为淋巴管和血管标记物的可行性,观察其标记的乳腺癌组织中淋巴管和血管的形态学表现和分布特点以及它们受癌细胞浸润的病理学特征;分析淋巴管浸润和血管浸润与乳腺癌临床病理各参数间的关系,探讨其在乳腺癌淋巴转移过程中的价值及其临床意义。方法通过电脑病案数据库检索2007年4月至2008年12月间南方医院住院并经手术治疗的乳腺癌病例,共计191例。从中选择临床资料和病理诊断资料完善的病例,选取浸润性导管癌做为研究对象。剔除临床资料不完整、少数民族、术前曾接受放化疗等辅助性治疗、乳腺癌复发、腋窝淋巴结清扫数目较少(小于10个)病例。通过电脑随机抽取其中72例。另随机抽取同期的乳腺良性病变10例作为对照。所选取的乳腺癌病例全部行HE染色、ER、PR、Her-2、VEGF及EGFR免疫组化染色,从病理科获得所选病例的病理切片以及石蜡块,选择合适的石蜡块制作免疫组化病理白片。采用Envision试剂盒行二步法免疫组化染色。石蜡切片脱蜡至水,柠檬酸缓冲液微波高档抗原修复25分钟,双蒸水冲洗3次,PBS冲洗3次,每次3分钟;过氧化氢酶阻断液微波低档孵育3分钟,清除内源性过氧化物酶活性,双蒸水冲洗3次,PBS冲洗3次,每次3分钟;滴加D2-40或CD34一抗,电热恒温培养箱37℃孵育1小时,PBS冲洗3次;滴加酶标羊抗鼠IgG聚合物二抗试剂,培养箱中37℃孵育30分钟,PBS漂洗3次;室温下DAB试剂显色约5分钟(3-10分钟),自来水冲洗后苏木素轻度复染约1分钟,盐酸酒精分化约6秒,酒精脱水、二甲苯透明后中性树胶封固切片。染色可疑者即行重新标记染色。以PBS取代一抗作阴性对照,以已知阳性反应片作阳性对照。根据阳性和阴性对照的显色情况,在确定无假阳性和假阴性的前提下。淋巴管内皮标记物D2-40免疫组化染色以胞浆和(或)胞膜呈清晰棕黄色颗粒为阳性表达,包括被染成棕黄色的微管、单个内皮细胞或细胞丛;血管内皮标记物CD34染色阳性标准:每一个染成棕黄色的,可与周围血管、肿瘤细胞和其他结缔组织区分开的管腔封闭的内皮细胞或内皮细胞簇,不论管腔和红细胞出现与否,均作为一个单一的、可计数的血管。D2-40和CD34阳性的淋巴管和血管内有癌细胞浸润即可判定淋巴管浸润或血管浸润。采用SPSS13.0统计分析软件包进行数据处理,组间差异性比较采用四格表或行列表卡方检验,两因素相关性分析采用Spearman相关分析,相关系数用r表示,以P<0.05表示差异具有统计学意义。结果1、D2-40和CD34在所有乳腺癌组织中均有阳性表达,D2-40在4例乳腺良性病变组织中出现阳性表达,乳腺癌组和良性病变组D2-40阳性表达率有显著差异(x~2=46.611,P=0.000),CD34在所有良性病变组织中有阳性表达。乳腺癌组织血管可随机分布于肿瘤中央或周边,淋巴管多分布于癌瘤周边间质组织内,尤其出现在癌与正常组织交界部位。癌组织中央部位淋巴管多为狭窄,甚至为闭锁状或缺如状态,外周淋巴管常表现为扩张状。与CD34标记的血管相比,D2-40标记的阳性脉管管壁较薄,多数不完整,形态不规则、管腔大小不一,管壁为单层扁平上皮,无肌层,较薄,无红细胞和中性粒细胞填充,且邻近可见腔内不着色的血管。CD34标记的血管不仅血管阳性表达,间质成分亦常见CD34阳性着色,需要结合形态学综合判定。良性对照组患者乳腺组织中血管和淋巴管数量较稀少,淋巴管多为闭锁状。2、乳腺浸润性导管癌组织淋巴管内癌细胞浸润标记阳性率(LVI)为69.4%,癌组织血管内癌细胞浸润标记阳性率(BVI)为52.8%,LVI阳性率高于BVI,差异有统计学意义(x~2=4.208,P=0.040)。良性组未发现有淋巴管或血管内瘤性细胞浸润。癌栓浸润脉管的形式可表现为单个癌细胞或数个癌细胞或癌细胞团,癌细胞团甚至可全部填充整个脉管,且癌细胞浸润脉管大多表现为贴附于管壁;淋巴管浸润与淋巴管的分布特点一致,癌组织周边部位淋巴管分布较密集,LVI较多见,癌巢中央淋巴管浸润较周边部位少见,周边正常脂肪组织和癌周浅筋膜组织亦可见癌细胞淋巴管浸润。血管内癌细胞浸润分布于癌组织中央或癌组织周边正常组织,无一定规律。不成熟的内皮细胞形成的不完全性血管腔浸润容易发现,但尚不能判定为血管内癌细胞浸润阳性。3、乳腺癌淋巴结转移组LVI阳性率85.7%,未转移组LVI阳性率54.1%,转移组高于阴性组,差异具有统计学意义(x~2=8.496,P=0.004);与患者腋窝淋巴结转移呈显著正相关关系(r=0.382,P=0.001),在淋巴结转移数目大于10个患者中,LVI阳性率最高(100%),淋巴结阴性组LVI阳性率最低(54.1%),各组间阳性率差异显著(x~2=10.700,P=0.013)。BVI阳性率在淋巴结转移组为68.6%,未转移组为37.9%,转移组高于未转移组,差异有统计学意义(x~2=6.817,P=0.009);BVI与腋窝淋巴结转移呈显著正相关(r=0.332,P=0.004),随淋巴结转移数目的增多,BVI阳性率明显升高,各组间阳性率有显著性差异(x~2=8.125,P=0.043)。LVI和BVI与年龄大小无关(r=-0.042,P=0.729;r=0.220,P=0.854),阳性率在各组间无显著差异(x~2=0.657,P=0.720;x~2=0.043,P=0.979);与肿瘤大小、组织学分级显著正相关(r=0.407,P=0.000,r=0.334,P=0.004),各组间阳性率差异显著(x~2=13.192,P=0.001;x~2=8.698,P=0.013);LVI与临床分期无关(r=0.102,P=0.393),各组间阳性率差异无统计学意义(x~2=2.089,P=0.352),BVI与临床分期显著相关(r=0.543,P=0.000),各组间阳性率差异显著(x~2=22.614,P=0.000);LVI与ER、PR显著负相关(r=-0.406,P=0.000;r=-0.341,P=0.003),各组间阳性率差异显著(x~2=17.369,P=0.001;x~2=9.280,P=0.026),与Her-2、VEGF和EGFR显著正相关(r=0.357,P=0.002;r=0.435,P=0.000;r=0.267,P=0.024),各组间差异显著(x~2=9.912,P=0.019;x~2=16.102,P=0.001;x~2=6.261,P=0.100);BVI与VEGF显著正相关(r=0.405,P=0.000),各组间差异有统计学意义(x~2=13.219,P=0.004),与ER、PR、Her-2及EGFR均无关(r=-0.156,P=0.192;r=-0.143,P=0.232;r=0.074,P=0.534;r=0.160,P=0.180),各组间阳性率差异无统计学意义(x~2=2.300,P=0.512;x~2=4.812,P=0.186;x~2=3.996,P=0.262;x~2=7.534.P=0.057)。结论1、D2-40标记淋巴管特异性较强,染色效果较好,可做为可靠的淋巴管标记物,CD34染色效果较好,特异性不强,不仅血管染色,周围间质亦阳性染色。2、在乳腺癌淋巴转移过程中,癌细胞可能先浸润淋巴管,血管浸润较淋巴管浸润晚,癌细胞浸润的血管可能是肿瘤中已存在的血管,侵入血管的癌细胞可进一步诱导新生血管的形成。3、LVI和BVI与乳腺癌腋窝淋巴结转移密切相关,可早于淋巴结转移出现,与大多乳腺癌不良预后指标相关,提示其可能为一个不良预后指标,是估计病情进展,判断预后,并制定有针对性的治疗方案以及客观评价疗效的重要指标之一。因此,乳腺浸润性导管癌血管内与淋巴管内浸润应做为乳腺癌临床病理分期的独立分级指标,可能为肿瘤预后不良因子之一。乳腺癌细胞血管内与淋巴管内浸润应推荐作为常规临床病理学检测项目。
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