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水稻Ac/Ds标签突变体库的构建及其遗传利用

作　者: 刘家范
导　师: 陈建民；程祝宽
学　校: 扬州大学
专　业: 遗传学
关键词: 水稻 Ac/Ds标签系统插入突变体库转座子功能基因组学
分类号: S511
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

随着水稻基因组测序的完成,功能基因组学研究正成为水稻分子生物学研究的重要内容。突变体库的构建是功能基因组学研究的一条重要而有效的途径。转座子标签法是一种利用转座因子插入高等植物基因组中造成基因突变,通过分离转座因子插入的旁邻序列,进而克隆出突变基因的策略。利用Ac/Ds标签系统构建插入突变体库是较为理想的方法。本研究将玉米转座子Ac和Ds分别导入粳稻品种盐稻8号基因组,利用Ds的可控异源转座,构建水稻插入突变体库;探索并完善了利用Ac/Ds标签系统构建插入突变体库的体系;对转基因植株做了初步分析;同时利用Tail-PCR克隆了部分插入突变体的T-DNA与Ds旁邻序列、并对所得插入突变体进行了遗传分析与生物信息学研究,取得了以下结果:1、将玉米转座子Ac和Ds分别转入粳稻品种盐稻8号,获得了148个转Ac的转化植株和215个转Ds的转化植株(各转化植株来自不同愈伤)。2、通过PCR分析、潮霉素抗性检测和GFP检测,共检测出130株含Ac的阳性植株,208株含Ds的阳性植株,阳性率分别为87.8℅和96.7℅。3、转基因T1代植株表型调查获得18种突变表型,通过遗传分析初步确定为T-DNA插入突变体的有8株,其中6株已通过Tail-PCR扩增出旁侧序列并预测了相应的突变基因。4、选出T-DNA单拷贝插入但没有突变表型的Ac和Ds转基因植株各44和72株,将Ac和Ds株系分别作为父本和母本进行杂交,以产生可以诱导Ds转座的后代群体。5、检测出了T0代杂交所得F1代中同时含有Ac和Ds的植株16株,让其自交得F2代。F2代选择仅含Ds的株系通过PCR、GUS染色以及Tail-PCR等方法进行转座分析,有8个株系后代检测到了转座,转座率为50℅。6、通过F2代突变表型调查,获得5株有明显突变表型的植株,其中两株已证明Ds发生了转座。通过Tail-PCR分离了Ds旁侧序列,并确定它们的插入位点。

全文目录

中文摘要  6-7
英文摘要  7-9
符号说明  9-11
第一章文献综述  11-17
  1 水稻基因组学研究进展  11-13
    1.1 结构基因组  11-12
    1.2 功能基因组  12-13
  2 水稻突变体库的创建  13-16
    2.1 突变体创建的方法和途径  13-14
    2.2 插入突变体库的创建  14-16
  3 研究目的及意义  16-17
第二章利用Ac/Ds 标签系统构建水稻插入突变体库  17-37
  1 前言  17-18
  2 材料与方法  18-27
    2.1 实验材料  18-21
      2.1.1 转化水稻受体材料  18
      2.1.2 菌株及双元载体  18-19
      2.1.3 试剂及药品  19
      2.1.4 培养基  19-21
    2.2 实验方法  21-27
      2.2.1 根癌农杆菌介导水稻转化  21-22
      2.2.2 转基因植株检测分析  22-23
        1）转基因水稻植株中潮霉素抗性的检测  22
        2）转基因水稻植株总DNA 的PCR 分析  22-23
      2.2.3 Southern 杂交检测外源基因拷贝数  23-25
      2.2.4 转基因植株T1 代分析  25
      2.2.5 转基因植株杂交  25-26
      2.2.6 杂交F1 代检测  26
      2.2.7 杂交F2 代检测  26-27
      2.2.8 杂交F2 代表型调查  27
  3 结果与分析  27-34
    3.1 根癌农杆菌介导水稻转化及检测  27-30
      3.1.1 转基因植株的获得  27-28
      3.1.2 转基因植株的PCR 检测  28-29
      3.1.3 Southern 杂交分析T-DNA 拷贝数  29-30
    3.2 转基因植株T1 代分析  30-32
      3.2.1 分离比检测  30
      3.2.2 转基因植株突变表型调查  30-32
    3.3 转基因植株杂交  32
    3.5 杂交F1 代检测  32
    3.6 杂交F2 代检测与表型调查  32-34
      3.6.1 Ac 和Ds 检测  32-33
      3.6.2 Ds 转座检测  33-34
      3.6.3 突变表型调查及转座验证  34
  4 讨论  34-36
    4.1 农杆菌介导水稻转基因体系优化  34-35
    4.2 利用Ac/Ds 转座子构建水稻插入突变体库系统的完善  35-36
  5 小结  36-37
第三章水稻Ac/Ds 标签突变体库的遗传利用  37-49
  1 前言  37
  2 实验材料  37-38
  3 实验方法  38-42
    3.1 遗传分析  38
    3.2 突变基因克隆与分析  38-42
      3.3.1 Tail-PCR 扩增插入突变体插入片段旁侧序列  38-41
      3.3.2 旁侧序列验证及插入突变基因预测  41
      3.3.3 RNAi 载体的构建  41-42
  4 实验结果  42-47
    4.1 遗传分析  42
    4.2 突变基因克隆与分析  42-47
      4.2.1 Tail-PCR 扩增插入突变体插入片段旁侧序列  42-45
      4.2.2 旁侧序列验证及插入突变基因预测  45-46
      4.2.3 RNAi 载体的构建  46-47
  5 讨论  47-48
  6 小结  48-49
参考文献  49-52
致谢  52

水稻Ac/Ds标签突变体库的构建及其遗传利用

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