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肌酸激酶是具有凝集素活性的抑菌因子

作　者: 安艳
导　师: 张士璀
学　校: 中国海洋大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 文昌鱼头索动物肌酸激酶急性时相反应
分类号: Q55
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 33次
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内容摘要

肌酸激酶(creatine kinase, CK)又称为肌酸磷酸激酶或磷酸肌酸激酶,属于ATP呱基磷酸转移酶家族的一员,可逆地催化ATP与ADP之间的转磷酰基反应,反应中消耗磷酸肌酸生成肌酸。从低等的海绵动物到高等的脊椎动物,众多物种中都证实有CK的存在。CK在组织能量代谢过程中发挥至关重要的作用。临床上,细胞中CK浓度和活性的变化可用于多种疾病的诊断。最近的研究表明文昌鱼体液中的CK是一种急性时相蛋白,但对其免疫功能知之甚少。本文对青岛文昌鱼(Branchiostoma belcheri)CK基因(BbCK)的表达和功能进行了研究。首先,我们用Real-time PCR技术分析细菌外毒素LPS对BbCK基因表达的影响。实验结果表明,LPS处理文昌鱼能影响BbCK基因的表达,并且呈现浓度依赖性。用0.1μg/ml的LPS处理时, BbCK基因的表达水平变化甚微;用1、5和10μg/ml的LPS处理时,BbCK基因的表达水平显著升高,并分别于16小时、8小时和4小时达到峰值,这表明BbCK可能参与宿主免疫防御,与之前认为CK是文昌鱼体内一种急性时相蛋白的观点一致。其次,为了从蛋白水平上验证文昌鱼BbCK是否参与宿主免疫防御,我们构建原核表达载体,表达、纯化并复性重组蛋白BbCK。通过抑菌活性检测实验,发现重组蛋白BbCK对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌的生长无抑制作用,而对革兰氏阴性细菌大肠杆菌有明显的抑制作用。表明CK能识别入侵病原体,影响病原体的生长繁殖,从而参与宿主免疫,保护机体。再次,为了了解BbCK是如何参与宿主免疫的,我们对重组蛋白BbCK的抑菌机制进行了初步研究。碳水化合物对其抑菌活性的影响实验表明,重组蛋白BbCK对革兰氏阴性菌大肠杆菌的抑制作用能被多种碳水化合物所抑制,包括:N-乙酰甘露糖胺(N-acetyl-D-mannosamine)、N-乙酰葡萄糖胺(N-acetyl-D-glucosamine)、L-岩藻糖(L-fucose)、D-甘露糖(D-mannose)、D-果糖(D-fructose)、D-葡糖糖(D-glucose)。证明CK能特异性识别革兰氏阴性菌大肠杆菌,是通过与其细胞表面的糖结合从而抑制其生长参与到宿主免疫防御,表现出凝集素的活性。本实验是首次证明CK是具有凝集素活性的抑菌因子。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-10
第一章文献综述  10-29
  1. 研究脊椎动物起源与进化的珍贵模式动物---文昌鱼  10-18
    1.1 文昌鱼的命名和分类  10-11
    1.2 文昌鱼的形态结构  11-16
    1.3 文昌鱼的生活习性  16
    1.4 文昌鱼的胚胎发育  16-17
    1.5 文昌鱼免疫方面的研究进展  17-18
  2. 免疫系统概述  18-20
    2.1 无脊椎动物免疫系统  19-20
    2.2 脊椎动物免疫系统  20
  3. 凝集素的概述  20-23
    3.1 无脊椎动物凝集素  21-22
    3.2 文昌鱼凝集素  22-23
    3.3 脊椎动物凝集素  23
  4. 肌酸激酶的研究进展  23-27
    4.1 肌酸激酶的功能  23-25
    4.2 肌酸激酶的分布  25-26
    4.3 肌酸激酶的结构  26
    4.4 肌酸激酶的复性  26-27
  5. 研究目的及技术路线  27-29
    5.1 研究目的  27-28
    5.2 技术路线  28-29
第二章青岛文昌鱼肌酸激酶基因的表达和功能分析  29-59
  1 前言  29
  2 材料与方法  29-46
    2.1 Real-time PCR 分析LPS 对BbCK 基因表达的影响  29-35
    2.2 重组蛋白pET32a/BbCK 的原核表达  35-44
    2.3 原核融合表达载体pET32a（TRX-His-tag）的表达  44
    2.4 重组蛋白BbCK 复性后的酶活力测定  44-45
    2.5 重组蛋白BbCK 复性后的抑菌活性检测  45
    2.6 碳水化合物对重组蛋白BbCK 复性后抑菌活性的影响  45-46
  3 结果  46-55
    3.1 Real-time PCR 分析LPS 对BbCK 基因表达的影响  46-48
    3.2 重组蛋白pET32a/BbCK 原核表达  48-52
    3.3 TRX-His-tag 的表达  52-53
    3.4 重组蛋白BbCK 复性后的酶活力测定  53
    3.5 重组蛋白BbCK 复性后的抑菌活性检测  53-54
    3.6 碳水化合物对重组蛋白BbCK 复性后抑菌活性的影响  54-55
  4 讨论  55-57
    4.1 文昌鱼BbCK 基因的调控表达  55-56
    4.2 文昌鱼BbCK 基因的功能研究  56-57
  5 总结与展望  57-59
参考文献  59-64
附录  64-65
  缩略语  64-65
致谢  65-66
个人简历  66
发表的学术论文  66

肌酸激酶是具有凝集素活性的抑菌因子

内容摘要

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