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组织工程角膜的构建及其细胞转化诱导研究

作　者: 唐光霞
导　师: 陈建苏
学　校: 暨南大学
专　业: 眼科学
关键词: 肾纤维囊血祖内皮细胞脐静脉血管内皮细胞角膜基质细胞角膜内皮组织工程
分类号: R318.0
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 47次
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内容摘要

目的:(1)探索以脱细胞的肾纤维囊作为载体培养角膜基质细胞并研究培养角膜基质细胞特性;(2)探讨眼房水对角膜基质细胞生长的作用;(3)体外培养脐静脉血管内皮细胞,通过在肾纤维囊上和基质细胞双面共培养、加入10%的房水和bFGF进行细胞诱导转化,探讨以脐静脉血管内皮细胞为种子细胞重建角膜内皮的可行性;(4)体外培养外周血祖内皮细胞,通过细胞共培养、加入10%的房水和10ng/ml bFGF进行细胞诱导转化,探讨以血祖内皮细胞为种子细胞重建角膜内皮的可行性。方法:(1)将培养扩增的兔角膜基质细胞分别接种到培养板和肾纤维囊上进行体外培养,通过免疫组化(波形蛋白)和免疫荧光(AO、PI和Hoechst)的方法进行检测,观察兔角膜基质细胞在培养板和肾纤维囊上的生长情况;(2)在实验组的培养基中加入2.5-20%房水,对照组不加,用明胶酶谱检测基质金属蛋白酶(MMP)和CCK8检测细胞的增殖情况;(3)采用消化法分离培养脐静脉血管内皮细胞,在肾纤维囊膜的一面接种角膜基质,另一面接种脐静脉血管内皮细胞,在内皮细胞完全培养液中加入10%的房水和10ng/ml bFGF,采用倒置显微镜、HE染色、免疫荧光鉴定和扫描电镜观察脐静脉血管内皮细胞的转化诱导情况;(4)用淋巴细胞分离液从成人外周血中分离培养血祖内皮细胞,在肾纤维囊膜的一面接种角膜基质,另一面接种血祖内皮细胞,在内皮细胞完全培养液中加入10%的房水和10ng/ml bFGF,采用倒置显微镜、HE染色、免疫荧光鉴定和扫描电镜进行形态学和超微结构观察。结果:(1)倒置显微镜和免疫荧光显微镜观察结果显示角膜基质细胞在肾纤维囊上快速贴壁生长并增殖,细胞形态呈多角形树枝状,多次传代后细胞仍维持原有的形态和功能,细胞能长期培养存活。在培养板上培养的细胞呈长梭形,细胞贴壁生长和增殖情况稍差。在肾纤维囊上的活细胞较在培养板上培养的细胞多。(2)明胶酶谱电泳分析可见清晰的MMP2和MMP9条带,随着加入房水浓度的增加,条带亮度逐渐增加。细胞培养1-5天CCK8细胞增殖检测发现实验组吸光度比常规培养组显著增加(P＜0.05)。(3)脐静脉血管内皮细胞在培养6h时可见部分细胞贴壁,伸出伪足,约在7d时融合成单层,呈铺路石状镶嵌排列。Ⅷ因子单克隆抗体标记的脐静脉血管内皮细胞免疫荧光染色阳性。脐静脉血管内皮细胞经诱导转化第14d,神经纤维丝单克隆抗体检测,表达阳性。(4)可见血祖内皮细胞大小较均匀,呈长梭形或圆形,细胞形态典型。CD34荧光标记的血祖内皮细胞免疫荧光染色阳性。血祖内皮细胞经诱导转化14d后,用水通道蛋白1检测,表达阳性。结论:(1)角膜基质细胞在脱细胞的肾纤维囊载体上生长良好,细胞形态结构明显。本研究为角膜基质细胞的体外培养,提供了简单和高效的方法,同时为组织工程的研究提供理想的载体材料;(2)采用在肾纤维囊上和角膜基质细胞双面共培养、加入10%的房水和10ng/ml bFGF的方法,可以促进脐静脉血管内皮细胞和血祖内皮细胞一定程度的转化诱导效果,有望成为重建组织工程角膜内皮层的种子细胞。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-8
目录  8-10
前言  10-18
  1.组织工程角膜基质层的研究  10-12
  2.组织工程角膜内皮层的研究现状  12-13
  3.房水对培养细胞作用的研究  13
  4.角膜相关细胞转化诱导的研究现状  13-16
  5.本实验研究的目的和意义  16-18
第一部分:肾纤维囊作为载体培养角膜基质细胞的研究  18-30
  引言  18
  材料和方法  18-24
  结果  24-25
  讨论  25-28
  附图  28-30
第二部分:前房水对培养角膜基质细胞的作用  30-37
  引言  30
  材料和方法  30-33
  结果  33-36
  讨论  36-37
第三部分:脐静脉血管内皮细胞的培养及其诱导转化的研究  37-45
  引言  37
  材料和方法  37-39
  结果  39-40
  讨论  40-43
  附图  43-45
第四部分:血祖内皮细胞的培养及其诱导转化的研究  45-51
  引言  45
  材料和方法  45-47
  结果  47-48
  讨论  48-49
  附图  49-51
全文结论  51-52
问题与展望  52-53
参考文献  53-61
主要英文缩略词  61-62
在校期间发表文章  62-63
致谢  63

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