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内蒙古绒山羊皮肤干细胞定位的初步研究

作　者: 郑琰
导　师: 周欢敏
学　校: 内蒙古农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 绒山羊标记毛囊皮肤干细胞 5-溴-2-脱氧尿嘧啶免疫组织化学技术定位
分类号: S827
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

本论文旨在探讨BrdU标记内蒙古绒山羊皮肤组织的可行性及免疫组织化学检测的最优条件,并对皮肤干细胞的分布位置、迁移轨迹进行初步研究。通过对绒山羊颈部静脉注射不同剂量BrdU,活体取背部皮样,经4%多聚甲醛固定,石蜡包埋切片,免疫组织化学技术检测不同的BrdU注射剂量、二抗及链霉菌抗生物素-过氧化物酶浓度、抗原修复方式、DNA变性温度对BrdU标记结果的影响,以寻求检测的最佳条件。同时,根据干细胞的标记滞留性,观察BrdU标记在皮肤中的分布位置。选择BrdU标记滞留期的绒山羊背部皮样,对标记物集中分布的部位进行体外分离培养,并对同期皮肤组织进行干细胞表面标志P63的鉴定。结果表明:实验组山羊皮肤组织中有红色的BrdU阳性细胞的分布,其以PBS代替一抗的阴性对照以及未注射BrdU的空白对照山羊皮肤组织中无BrdU阳性细胞出现。不同BrdU标记剂量对免疫组织化学染色效果无明显区别;当2M HCl 37℃变性30min,胰蛋白酶37℃修复30min,生物素标记的第二抗体和链霉菌抗生物素-过氧化物酶的稀释度为1∶100时,免疫组化检测结果最理想。BrdU可以用于内蒙古绒山羊短时期的体内标记,在本实验中,标记存留时间为10周。标记滞留细胞存在于初级毛囊、次级毛囊以及表皮基底层,并且主要集中分布在毛球部以及外根鞘,并发现标记滞留细胞有向上迁移的现象。在此基础上,取BrdU标记的绒山羊背颈部皮肤,用酶消化法和机械法分离完整毛囊,对毛球部及外根鞘的细胞进行体外分离、IV型胶原黏附筛选,经培养形成典型的铺路石状的细胞克隆,且细胞多呈圆形或多边形、核大,符合干细胞的形态特征。P63表达于毛球部、毛囊外根鞘,其表达部位与BrdU的标记滞留位置基本一致。以上结果说明了皮肤干细胞的显著特征—慢周期性、高度的增殖潜能以及黏附性,初步证明绒山羊的初级毛囊、次级毛囊以及表皮组织中存在类皮肤干细胞,并且位于毛囊的毛球部以及外根鞘。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-12
1 引言  12-23
  1.1 皮肤毛囊结构概述  12-18
    1.1.1 皮肤的结构  12-14
    1.1.2 毛囊的基本结构  14-15
    1.1.3 毛囊的周期性变化及调控  15-18
  1.2 皮肤干细胞的研究进展  18-22
    1.2.1 皮肤干细胞的特征  18-19
    1.2.2 皮肤干细胞的类型及定位  19-20
    1.2.3 皮肤干细胞的分离培养  20-21
    1.2.4 皮肤干细胞的标志  21
    1.2.5 皮肤干细胞的应用  21-22
  1.3 研究目的与意义  22-23
2 实验一 BrdU 标记绒山羊皮肤组织的免疫组织化学检测  23-33
  2.1 实验材料  23-25
    2.1.1 实验动物  23
    2.1.2 实验试剂与药品  23
    2.1.3 标记物及抗体  23-24
    2.1.4 实验仪器与设备  24
    2.1.5 主要液体的配制  24-25
  2.2 实验方法  25-27
    2.2.1 标记剂量  25
    2.2.2 皮样处理  25
    2.2.3 载玻片的预处理  25
    2.2.4 SAPIC 法染色  25
    2.2.5 免疫组织化学S-P 法检测BRDU  25-27
  2.3 结果与讨论  27-33
    2.3.1 皮肤切片的SAPIC 法染色  27-28
    2.3.2 免疫组化AEC 染色结果  28
    2.3.3 石蜡包埋及展片  28-29
    2.3.4 BRDU 标记物的特点  29
    2.3.5 标记剂量的比较  29-30
    2.3.6 变性温度的比较  30-31
    2.3.7 组织抗原不同修复方法的比较  31-32
    2.3.8 生物素标记的第二抗体稀释度比较  32
    2.3.9 链霉菌抗生物素-过氧化物酶稀释度比较  32-33
  2.4 小结  33
3 实验二绒山羊皮肤干细胞的定位与迁移  33-39
  3.1 实验材料  33-34
    3.1.1 实验试剂与药品  33
    3.1.2 实验仪器与设备  33
    3.1.3 主要液体的配制  33
    3.1.4 实验动物  33-34
  3.2 实验方法  34
    3.2.1 BRDU 活体标记  34
    3.2.2 绒山羊皮肤组织的采集与固定  34
    3.2.3 免疫组织化学检测BRDU 在皮肤中的分布  34
  3.3 结果与讨论  34-39
    3.3.1 标记滞留细胞在皮肤中的定位分布  34-37
    3.3.2 标记滞留细胞的迁移  37-39
  3.4 小结  39
4 实验三毛囊BrdU 标记滞留部分的体外培养  39-44
  4.1 实验材料  40
    4.1.1 实验试剂与药品  40
    4.1.2 实验仪器与设备  40
    4.1.2 主要液体的配制  40
  4.2 实验方法  40-41
    4.2.1 标本处理  40
    4.2.2 培养板的处理  40
    4.2.3 毛囊的分离  40
    4.2.4 原代培养  40-41
    4.2.5 传代培养  41
    4.2.6 P63 的免疫组织化学鉴定  41
  4.3 结果与讨论  41-44
    4.3.1 绒山羊毛囊的分离  41-42
    4.3.2 绒山羊类毛囊干细胞的培养  42-43
    4.3.3 P63 的免疫组织化学鉴定分析  43-44
  4.4 小结  44
5 结论  44-46
致谢  46-47
参考文献  47-49
作者简介  49

内蒙古绒山羊皮肤干细胞定位的初步研究

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