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产L-肉碱脱水酶菌株发酵及酶催化条件的研究

作　者: 张钟元
导　师: 王强
学　校: 中国农业科学院
专　业: 农产品加工与贮藏工程
关键词: L-肉碱 L-肉碱脱水酶发酵条件发酵动力学酶催化
分类号: TQ920.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

L-肉碱的主要生理功能是作为载体将长链脂肪酸从线粒体膜外转运到膜内,为脂肪降解和代谢提供能量。目前,酶催化底物生物转化L-肉碱是国际上公认的高效制备方法,但国内对L-肉碱生物转化的研究起步较晚,且技术不全面。本论文主要对影响L-肉碱脱水酶生成的发酵条件进行研究,对酶催化合成L-肉碱的条件进行优化,为L-肉碱的高效生物转化提供理论依据。建立了一种L-肉碱脱水酶活力定量测定的方法。通过底物巴豆甜菜碱的消耗量来表达酶活,采用紫外法（UV）和酶法（DTNB）相结合的方法测定酶活力。对两种方法测得的酶活力进行拟合,得到最佳拟合方程为: （其中X为紫外法测定的L-肉碱脱水酶活力,y为DTNB法测定的L-肉碱脱水酶活力）。结果表明UV法经拟合后用于测定L-肉碱脱水酶活力快速、准确、成本低廉。优化了L-肉碱脱水酶的发酵条件。首先对碳源、氮源、诱导物等单因素实验,在此基础上,设计二次正交旋转组合实验,经二次多项式逐步回归分析,得到培养基模型方程为: Y=5.222+0.197X₁-0.068X₂+0.022X₃+0.016X₄-0.176X₁²-0.111X₂²-0.086X₃²-0.127X₄²+0.090X₁X₂+0.048X₁X₃+0.040X₁X₄。响应面分析确定了最佳培养基组分（g/100 ml）为:蛋白胨0.678、酵母膏0.961、巴豆甜菜碱0.335、富马酸2.093。培养基优化后,L-肉碱脱水酶活力由原来的1.90U增加到5.32U。适宜的发酵条件通过单因素及正交实验确定为:起始pH7.0、接种量1 ml/100ml、温度30℃、转速120 r/min、装液量100 ml/瓶,主次影响因素为转速>接种量>装液量>温度>起始pH,此条件下L-肉碱脱水酶活力达到5.78±0.12 U。研究了菌体5L发酵罐的分批发酵条件和发酵动力学。较好的菌体生长和产酶pH为7.5,相比于未调pH的发酵过程,菌体生物量增加显著,产酶效率明显提高,且产酶活力提高幅度较大。一定范围内搅拌转速有利于细菌的生长,随着转速的提高菌体生物量增加,当搅拌转速400r/min时,整个发酵过程菌体产酶活力较高。采用Logistic方程、Luedeking-Piret方程和Luedeking-Piret-Like方程描述了菌体发酵动力学规律,得到方程如下:菌体生长动力学方程为L-肉碱脱水酶的生成动力学方程为p = 1.4697 A（ t ） + 0.001506 B （t ）,式中;巴豆甜菜碱消耗动力学方程为,式中研究了肉碱脱水酶催化合成L-肉碱的条件。适宜的反应条件为:温度40℃,pH7.0,巴豆甜菜碱浓度2%,酶添加量2%,富马酸作为电子受体,酶反应时间5-8 h。Mg²⁺作为酶抑制剂降低酶活力,Zn²⁺、K⁺、Cu²⁺、Li⁺、Ba²⁺、Fe²⁺作为酶激活剂均能提高酶活力,其中以Fe²⁺对酶活力的激活作用最为明显。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-14
第一章绪论  14-25
  1.1 L-肉碱化学结构及性质  14
  1.2 L-肉碱的生理功能  14
  1.3 L-肉碱制备技术的研究进展  14-18
    1.3.1 化学合成L-肉碱  14-15
    1.3.2 酶法制备L-肉碱  15-17
    1.3.3 直接发酵法制备L-肉碱  17-18
  1.4 L-肉碱脱水酶休止细胞的研究进展  18-19
  1.5 L-肉碱检测方法  19-20
    1.5.1 酶法检测  19
    1.5.2 色谱法检测  19-20
    1.5.3 旋光法检测  20
  1.6 L-肉碱的应用  20-23
    1.6.1 L-肉碱的营养、保健功能及应用  21-22
    1.6.2 L-肉碱的疗效功能及临床应用  22-23
  1.7 研究目的  23-24
  1.8 实验内容和设计  24-25
第二章 L-肉碱脱水酶检测方法的建立  25-34
  2.1 前言  25
  2.2 材料与方法  25-27
    2.2.1 主要仪器和试剂  25-26
    2.2.2 方法  26-27
  2.3 结果与讨论  27-33
    2.3.1 紫外分光光度法对酶活的测定  27-29
    2.3.2 DTNB 酶法对酶活的测定  29-30
    2.3.3 线性与非线性拟合方程的建立  30-31
    2.3.4 拟合方程的验证  31-33
    2.3.5 紫外检测法的灵敏度实验  33
  2.4 小结  33-34
第三章产 L-肉碱脱水酶发酵条件优化  34-52
  3.1 前言  34
  3.2 材料与方法  34-36
    3.2.1 主要仪器和试剂  34-35
    3.2.2 菌株及培养基  35
    3.2.3 方法  35-36
  3.3 结果与讨论  36-51
    3.3.1 碳源筛选  36-37
    3.3.2 氮源筛选  37-39
    3.3.3 诱导物筛选  39-40
    3.3.4 正交旋转回归法确定最佳培养基  40-46
    3.3.5 发酵起始pH的影响  46-47
    3.3.6 接种量的影响  47-48
    3.3.7 温度的影响  48
    3.3.8 氧气的影响  48-50
    3.3.9 培养条件优化正交试验  50-51
    3.3.10 培养条件的验证实验  51
  3.4 小结  51-52
第四章 5L 发酵罐分批发酵条件及发酵动力学  52-64
  4.1 前言  52
  4.2 材料与方法  52-53
    4.2.1 主要仪器和试剂  52-53
    4.2.2 菌株及培养基  53
    4.2.3 方法  53
  4.3 发酵动力学模型的建立  53-55
    4.3.1 菌体生长动力学模型  54
    4.3.2 产物形成动力学模型  54-55
    4.3.3 底物消耗动力学模型  55
  4.4 结果与讨论  55-63
    4.4.1 pH对分批发酵的影响  55-57
    4.4.2 搅拌转速对分批发酵的影响  57-59
    4.4.3 奇异变形杆菌发酵动态曲线  59-60
    4.4.4 动力学模型的建立及各参数的评估  60-63
  4.5 小结  63-64
第五章 L-肉碱脱水酶催化条件的研究  64-73
  5.1 前言  64
  5.2 材料与方法  64-66
    5.2.1 主要仪器和试剂  64-65
    5.2.2 菌体细胞培养及收集  65
    5.2.3 L-肉碱脱水酶转化  65
    5.2.4 酶催化条件  65-66
  5.3 结果与讨论  66-72
    5.3.1 温度对酶催化的影响  66-67
    5.3.2 酶的热稳定性  67-68
    5.3.3 pH对酶催化的影响  68
    5.3.4 酶的酸碱稳定性  68-69
    5.3.5 底物浓度对酶催化的影响  69
    5.3.6 电子接受体的筛选  69-70
    5.3.7 酶的添加量对酶催化的影响  70-71
    5.3.8 酶催化时间的影响  71
    5.3.9 金属离子对酶催化的影响  71-72
  5.4 小结  72-73
第六章结论与展望  73-76
  6.1 全文总结  73-74
  6.2 创新点  74-75
  6.3 展望  75-76
参考文献  76-82
致谢  82-83
作者简历  83

产L-肉碱脱水酶菌株发酵及酶催化条件的研究

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