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PCR引物特异性评估体系及多重PCR引物设计系统的构建与应用

作　者: 申志勇
导　师: 张成岗
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: Primer3 MFEprimer MPprimer 引物特异性组合多重PCR
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

虽然聚合酶链式反应(PCR)技术已被广泛地用于大量生物医学研究,但是PCR过程中常见的非特异性扩增反应,一直是该技术的一个难点,严重影响了PCR的效果,特别是在多重PCR实验中,由于多个引物与模板DNA在一个试管中反应,更容易造成引物与模板的非特异性结合。然而,一直以来多重PCR引物设计被认为是一个NP-完全问题,即只能给出一个近似的算法来得到算法上的最优解,如:基于遗传算法为多重PCR设计最优的引物组合的方案等。归纳起来,针对多序列DNA模板的PCR引物设计,要么是设计多引物,要么是设计兼并引物,无论是哪种方式,虽然影响多重PCR实验结果的外在因素繁多而复杂,但针对物种的基因组和转录组范围内的引物特异性筛查是确保多重PCR实验成功的关键之一,而目前该领域尚缺乏一个有效的工具来设计、评估、筛选引物。本文首先针对PCR中可能出现的非特异性扩增,为了最大限度地降低非特异性产物的出现率,同时避免用户频繁使用Blast比对检查非特异性,对PCR实验前的引物进行特异性评估,开发了基于NCBI-Blast的引物评估和模板DNA特异性结合能力评估的,常用物种基因组和转录组数据库的引物特异性评估系统(PSC),并基于虚拟PCR实验确定了用于引物质量核查计算的多种参数,能够在线提供多个物种的引物特异性核查结果。该系统可以有效地对引物序列可能产生的所有非特异性扩增进行预测,有助于实验前引物优化或者对非特异扩增结果进行解释,最终达到提高PCR效率的目的。依据反馈意见,PSC系统由简单的基于单因素(序列相似性)的PCR评估系统,升级为基于多因素(序列相似性,引物3’端稳定性,Tm值,PCR反应离子浓度等)的引物特异性评估系统(MFEprimer),使之更为科学合理,贴近实验,论文发表后,该系统受到国际认可。在成功开发了引物特异性评估系统MFEprimer后,我们在此基础上结合业界公认的Primer3引物设计软件,开发出了适合于多重PCR特异性引物组合设计的系统(MPprimer),可显著减少多重PCR实验中因引物组合设计的不合理而出现非特异性扩增条带的现象,提高了多重PCR实验的可靠性,并为实验人员提供了在线的虚拟电泳图模拟功能,使得多重PCR引物设计结果显现更为直观。通过分别对小鼠五个基因(beta-actin,B2m,Pgkl,GAPDH,Rpl13a)和线虫四个基因(F21A3.6,C26C6.7,act-1,R13A1.8)进行多重PCR实验验证,结果显示MPprimer所设计的引物组合效果良好,能较好地满足多重PCR实验的验证需求,避免非特异性条带的出现,为多重PCR引物设计领域提供了又一个简洁方便实效的引物特异组合设计工具。

全文目录

目录  4-7
英文缩略词表  7-8
摘要  8-10
Abstract  10-12
前言  12-15
  1.PCR技术简介  12-13
  2.PCR中非特异性扩增现象  13
  3.本研究总体技术路线与论文结构  13-15
第一章引物特异性核查系统(PSC)的构建  15-26
  1.1 引物特异性核查软件研究现状  15
  1.2 PSC所需数据库的建立  15-16
  1.3 PSC步骤原理与过程  16-17
  1.4 PSC参数的选择  17-20
    1.4.1 NCBI-Blast中参数的选择  17-19
    1.4.2 引物对匹配指数(PPMI)  19-20
  1.5 结果与讨论  20-25
    1.5.1 单对引物的常规PCR实验中PSC的应用  20-24
    1.5.2 多重PCR实验中PSC应用  24-25
  1.6 结论  25-26
第二章基于多因素引物特异性评估系统(MFEprimer)构建  26-34
  2.1 主要参数的添加与修订  26-29
    2.1.1 解链温度Tm计算  26-27
    2.1.2 自由能△G计算  27-29
    2.1.3 引物对覆盖参数PPC的计算  29
  2.2 高级选项设定  29-30
    2.2.1 一价离子浓度设定  29
    2.2.2 二价离子浓度设定  29
    2.2.3 脱氧核糖核酸浓度(dNTP)设定  29
    2.2.4 寡核苷酸浓度设定  29-30
  2.3 PCR实验成败的三个主要因素  30
  2.4 MFEprimer的web界面  30-32
  2.5 MFEprimer应用举例  32-33
  2.6 结论  33-34
第三章基于MFEprimer和Primer3的多重PCR引物设计系统(MPprimer)的构建  34-49
  3.1 多重PCR引物设计研究现状  34-35
  3.2 MPprimer的原理与实现过程  35
  3.3 引物对特异组合PPSC算法的原理与实现过程  35-37
  3.4 参数的选择与设定  37-38
    3.4.1 引物长度  37
    3.4.2 解链温度(Tm)值  37
    3.4.3 GC含量  37
    3.4.4 Max 3'stability  37
    3.4.5 Max self complementarity  37-38
    3.4.6 Max 3'self complementarity  38
    3.4.7 引物对特异组合总罚分(TPC)  38
    3.4.8 最小条带间距(MinBS)  38
  3.5 引物二聚体核查模块PriDimerCheck  38-40
    3.5.1 PriDimerCheck的web界面  39-40
  3.6 虚拟PCR电泳模拟  40-45
  3.7 MPprimer性能的实验验证  45-48
  3.8 结果与讨论  48
  3.9 结论  48-49
总结  49-50
参考文献  50-52
附录  52-66
  附录1  52-55
  附录2  55-56
  附录3  56-57
  附录4  57-62
  附录5  62-65
  附录6  65-66
综述与论文  66-75
个人简历  75-77
致谢  77

PCR引物特异性评估体系及多重PCR引物设计系统的构建与应用

内容摘要

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