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浸矿微生物氧化亚铁硫杆菌抗氟基因工程菌的构建

作　者: 潘文俊
导　师: 曹运长
学　校: 南华大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 生物冶金 氧化亚铁硫杆菌 抗氟 基因工程菌
分类号: TD925.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 68次
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内容摘要


背景与目的:氧化亚铁硫杆菌(Thiobacillus ferrooxidans,T.f)是1947年分离出来的新菌种,这是一种专性自养及极端嗜酸性的硫杆菌,它广泛分布在土壤、海水、硫磺泉以及沉积泉中,广泛应用于低品位铜矿、铀矿以及其他多种贵金属的浸出和回收,它是目前生物冶金中研究最多、最有经济效益的浸矿微生物。但是,由于该菌生长缓慢、细胞得率低,而且对铀、氟等一些离子缺乏抗性,所以在实际应用中限制了其应用范围,同时也对研究工作带来很多不便。本实验通过分子生物学技术,克隆抗氟基因flr-4,将其导入T.f1中,以期获得稳定遗传的抗氟基因工程菌。方法:1.应用RT-PCR技术,从秀丽隐杆线虫中克隆抗氟基因(flr-4),构建pET30a-flr-4原核表达载体,将其导入大肠杆菌BL21(DE3)中,利用SDS-PAGE及Western blot检测Flr-4蛋白的表达,通过生长动力学曲线,检测大肠杆菌抗氟能力的变化。2.构建pJRD215-flr-4载体,将其导入大肠杆菌SM10后,利用接合转移技术,将载体导入T.f1,检测pJRD215-flr-4的遗传稳定性,比较野生型T.f1和重组T.f1菌株在不同氟离子浓度条件下生长动力学曲线。结果:1.克隆了抗氟基因flr-4,构建了原核表达载体pET30a-flr-4,将其导入大肠杆菌BL21(DE3)后,检测到大肠杆菌中有特异性的融合蛋白的表达。野生型大肠杆菌BL21(DE3)在NaF为9.6g/L的TB培养基中生长受到抑制,而有融合蛋白Flr-4表达的重组大肠杆菌BL21(DE3)其生长不受影响。2.构建了pJRD215-flr-4载体,通过接合转移导入T.f1,野生型T.f1在NaF浓度为40mg/L以上就不再生长,而且在NaF浓度为20mg/L时到达稳定期时间为8天,重组T.f1在NaF浓度为60mg/L的情况下仍能生长,且在NaF浓度为20mg/L的情况下到达稳定期由原来8天缩短为4天。将重组T.f1在无选择压力的条件下,连续传代50代,质粒保留70%以上。结论:1.通过RT-PCR技术从秀丽隐杆线虫中克隆出抗氟基因flr-4,构建了原核表达载体pET30a-flr-4,并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)中。2.利用SDS-PAGE和Western blot技术检测到融合蛋白Flr-4在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达,并证实了抗氟基因的表达增强了大肠杆菌的抗氟能力。3.构建了pJRD215-flr-4表达载体,通过接合转移将载体导入到氧化亚铁硫杆菌T.f1中,获得了遗传稳定的抗氟基因工程菌,T.f1基因工程菌的抗氟能力提高了200%以上。

全文目录


主要英文缩略词  6-7
摘要  7-9
Abstract  9-11
1 引言  11-15
2 材料  15-23
  2.1 菌种与质粒  15
  2.2 主要试剂和药品  15-16
  2.3 常用培养基  16-19
  2.4 常用溶液的配制  19-21
  2.5 常用仪器  21-23
3 实验方法  23-36
  3.1 抗氟基因flr-4 的克隆  23-27
  3.2 pMD18-T-flr-4 载体的构建  27-29
  3.3 pET30a-flr-4 载体的构建  29-30
  3.4 pET30a-flr-4 载体转化大肠杆菌BL21(DE3)  30-31
  3.5 flr-4 基因的原核诱导表达  31
  3.6 Flr-4 蛋白的Western blot 检测  31-32
  3.7 抗氟基因的表达对大肠杆菌的影响  32
  3.8 重组载体pJRD215-flr-4 的构建  32-33
  3.9 pJRD215-flr-4 载体转化大肠杆菌SM10  33-34
  3.10 大肠杆菌和氧化亚铁硫杆菌T.f1 的接合转移  34-36
4 实验结果  36-47
  4.1 线虫的培养及RNA 的提取  36
  4.2 flr-4 基因的克隆  36-37
  4.3 pMD18-T-flr-4 载体的构建  37-38
  4.4 pET30a-flr-4 载体的构建  38-40
  4.5 抗氟基因的诱导表达  40-41
  4.6 抗氟基因的Western blot 检测  41-42
  4.8 pJRD215-flr-4 载体的构建  42-44
  4.9 接合转移子的鉴定  44
  4.10 质粒遗传稳定性检测  44-45
  4.11 重组质粒对氧化亚铁硫杆菌的影响  45-47
讨论  47-50
结论  50-51
参考文献  51-54
文献综述  54-65
  参考文献  61-65
成果目录  65-66
致谢  66

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中图分类: > 工业技术 > 矿业工程 > 选矿 > 选矿流程与方法 > 特殊选矿 > 细菌选矿
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