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嗜酸氧化亚铁硫杆菌铁氧还蛋白还原酶的表达纯化及酶活测定

作　者: 宋锦松
导　师: 曾嘉
学　校: 中南大学
专　业: 生物工程
关键词: 嗜酸氧化亚铁硫杆菌 铁氧还蛋白还原酶 酶动力学 结构模拟
分类号: Q814
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


铁氧还蛋白酶还原酶(ferredoxin NADP+ reductase, FNR)是一种广泛存在于动物、植物、真菌和微生物中的蛋白质,同时可以结合黄素腺嘌呤二核甘酸(flavin adenine dinucleotide, FAD)和还原型烟酰腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH),其主要功能是催化NADP(H)和铁氧还蛋白(ferredoxin)之间的反应,在电子传递链中具有相当重要的作用。本论文首先从A.ferrooxidans菌中克隆出铁氧还蛋白还原酶的基因,利用T4连接酶与含T7启动子的载体PLM I连接构建成一个新的质粒。T7启动子是来自T7噬菌体的启动子,具有高度的特异性,只有T7RNA聚合酶才能使其启动,可以使克隆化基因独自得到表达。然后使用大肠杆菌DH5α作为宿主,从而获得大量稳定的,高纯度的重组质粒,最后使用大肠杆菌BL21作为宿主,BL21含有lacUV5启动子,可以编码T7RNA聚合酶,并且它缺失表达ATP依赖型蛋白分解酶(La)的1on基因,这使它失去了外源的异型蛋白质具有特异性的分解作用,所以可以很好的表达克隆体目的蛋白。在优化的表达条件下表达蛋白,并通过一步亲和纯化法分离出带有组氨酸标签的目的蛋白FNR,借助考马斯亮蓝法,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和紫外光谱扫描等试验技术,我们知道了所表达的蛋白浓度为1.441μg/μl,分子量大小为36KDa,在380nm及450nm处有特征吸收峰。最后通过UV测的酶动力曲线,利用米氏方程和双倒数作图法分别测定了FNR在NADPH和EDTA-Fe3+双底物反应中KmNADPH=0.01787mmol/L, VmaxNADPH=0.0329mmol/L/min, KmEDTA-Fe1+=0.1437mmol/L VmaxEDTA-Fe3+=0.0011 mmol/L/min,本文还用Swiss-model模拟了FNR的分子结构用以帮助从空间结构上直观的了解该蛋白。以上结果对进一步研究FNR在A.ferrooxidans菌中的功能和结构奠定了基础。

全文目录


摘要  4-5
ABSTRACT  5-6
目录  6-8
第一章 绪论  8-23
  1.1 生物冶金(Bioleaching)  8-10
    1.1.1 研究进展  8-9
    1.1.2 面临的主要挑战  9
    1.1.3 A.ferrooxidans菌及其铁氧化系统介绍  9-10
  1.2 铁氧还蛋白还原酶(Ferredoxin-NADP+reductase,FNR)  10-22
    1.2.1 铁氧还蛋白还原酶简介  10-11
    1.2.2 FNR的结构  11-13
    1.2.3 FNR的系统分类  13-21
    1.2.4 FNR的催化机理  21-22
  1.3 课题的研究目的与研究内容  22-23
    1.3.1 依据和目的  22
    1.3.2 论文的主要研究内容  22
    1.3.3 论文课题受资助情况  22-23
第二章 实验方法  23-35
  2.1 实验的材料  23-28
    2.1.1 实验所用菌种  23
    2.1.2 实验所用培养基  23-24
    2.1.3 基因组提取试剂  24
    2.1.4 质粒提取试剂  24
    2.1.5 琼脂糖凝胶电泳  24-25
    2.1.6 快速胶回收纯化试剂  25
    2.1.7 不连续体系SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳  25-26
    2.1.8 SDS-PAGE胶保存试剂及装置  26-27
    2.1.9 亲和纯化试剂  27-28
    2.1.10 实验仪器与设备  28
  2.2 实验方法  28-33
    2.2.1 PCR扩增  28-29
    2.2.2 酶切PCR产物及载体pLM 1  29
    2.2.3 载体和目的片段的连接反应  29
    2.2.4 重组质粒的转化  29
    2.2.5 阳性克隆子的筛选  29-30
    2.2.6 重组质粒的转化  30
    2.2.7 蛋白质的表达条件  30-31
    2.2.8 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)  31-32
    2.2.9 蛋白质的纯化  32-33
  2.4 测试分析方法  33-35
    2.4.1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)  33
    2.4.2 紫外分光光度计扫描(UV Scanning)  33-34
    2.4.3 分子结构模型图的模拟(Molecular structure modeling)  34-35
第三章 铁氧还蛋白还原酶的表达纯化  35-41
  3.1 FNR基因的克隆  35-37
    3.1.1 FNR基因的克隆  35-36
    3.1.2 阳性克隆的筛选  36-37
  3.2 FNR的表达  37-40
    3.2.1 FNR表达条件的确定  37-38
    3.2.2 FNR大规模的表达  38
    3.2.3 SDS-PAGE分析铁氧还蛋白还原酶  38-39
    3.2.4 UV/Vis分析FNR  39-40
  3.3 本章小结  40-41
第四章 分子结构模拟  41-44
  4.1 序列分析  41
  4.2 结构模拟  41-43
  4.3 本章小结  43-44
第五章 活性测定  44-48
  5.1 测活方法  44-47
  5.2 测活结果  47
  5.3 本章小结  47-48
第六章 结论  48-49
参考文献  49-58
致谢  58-59
研究成果  59

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中图分类: > 生物科学 > 生物工程学（生物技术） > 酶工程
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