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禽流感病毒H9亚型福建分离株的全基因组测定及遗传演化分析

作　者: 林彬彬
导　师: 吴宝成；关育芳
学　校: 福建农林大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 禽流感病毒 H9亚型 全基因组序列 遗传演化分析
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


从福建省各县市2009-2010年每月流行病学调查中检测到的H9阳性样品中分离到CK 1 FJ 2010H9和CK 2 FJ 2010H9两株禽流感病毒(AIV)。经血凝抑制试验(HI)、基因组序列测定,结果表明,本研究分离到的2株毒株为H9亚型禽流感病毒。根据GenBank中收录的H9亚型AIV的8个基因序列,利用Primer 5.0软件分别设计合成相应的反转录引物和扩增引物,其中HA、PB1、PB2、PA基因分成两段扩增。提取尿囊液病毒RNA,运用RT-PCR分别成功扩增到2株H9亚型禽流感病毒的8个基因,并分别连接到pMD18-T载体上,转化到DH5α感受态细胞,提取质粒,进行PCR鉴定及其序列测定。结果表明:1、本研究所分离到的2株H9亚型禽流感病毒均属于典型的低致病性禽流感病毒模式,且均具有与人流感病毒受体结合的倾向。2、本研究成功扩增和克隆到2株我省H9亚型禽流感病毒的全基因组序列。HA、NA、M、NS、NP、PB1、PB2、PA 8个基因片段,核苷酸长度分别为1742bp、1463bp(CK 2 FJ 2010H9分离株为1454bp)、1027bp、890bp、1565bp、2341bp、2341bp和2233bp,均含有相应基因的完整开放阅读框,并分别编码560、469(CK 2 FJ 2010H9分离株为466)、350、339、498、757、759和716个氨基酸。HA裂解位点附近的氨基酸序列均为PSRSSR↓G,具有典型的低致病性禽流感病毒的特点。在HA肽链上,CK 1 FJ 2010H9分离株有7个保守的潜在糖基化位点,而CK 2 FJ 2010H9分离株有6个潜在的糖基化位点。在决定宿主特异性受体结合位点的226位位点上的氨基酸均为亮氨酸(L),均具有与人流感病毒受体结合的倾向。但CK 2 FJ 2010H9分离株比CK 1 FJ 2010H9分离株可能更倾向与人流感病毒受体结合,对人更具有易感性。在NA肽链上,CK 1 FJ 2010H9分离株不存在颈部缺失,有7个保守的潜在糖基化位点,而CK 2 FJ 2010H9分离株在第62位点由于3个氨基酸缺失导致缺失一个糖基化位点,只有6个潜在的糖基化位点。3、对我省2株H9亚型AIV分离株的全基因组进行同源性和遗传演化分析,结果表明,2株H9亚型禽流感病毒分离株HA、NA、M、NS、NP、PB1、PB2、PA 8个基因核苷酸同源性分别为94.6%、86.8%、95.6%、94.6%、94.9%、88.5%、95.5%、88.0%,其之间的HA、M、NS、NP、PB2基因的核苷酸具有较高的同源性。遗传进化分析,结果表明,这2株H9亚型AIV分离株的HA基因属于A/Duck/Hong Kong/Y280/97分支上,说明福建省2010年范围内存在的H9亚型AIV可能来源于同一祖先。PB2基因独自处于一分支,不在欧亚代表毒株亚群分支上,推测该基因可能来源于未知野禽毒株。CK 1 FJ 2010H9和CK 2 FJ 2010H9这2株分离毒株是2010年分离于我省的不同地区,地缘关系远,其每个毒株的8个基因,在遗传进化树上的分支不具有统一性,推测这2株毒株可能是由于从不同禽流感病毒毒株获得了某些基因片段而发生基因重排。

全文目录


摘要  8-10
Abstract  10-12
第一章 综述  12-23
  1 禽流感概述  12-13
  2 禽流感病原特征  13-17
    2.1 形态和结构  13
    2.2 禽流感病毒的分子生物学特性  13-17
      2.2.1 基因组及其蛋白组成  13-16
      2.2.2 禽流感病毒的分子进化与抗原变异  16-17
  3 禽流感病毒的致病机制  17-19
    3.1 血凝素（HA）与致病性关系  17
    3.2 神经氨酸酶（NA）与致病性关系  17-18
    3.3 核蛋白（NP）与致病性关系  18
    3.4 基质蛋白（M）与致病性关系  18
    3.5 非结构蛋白（NS）与致病性关系  18-19
    3.6 聚合酶复合体（PB1,PB2,PA）与致病性关系  19
  4 禽流感疫苗研究  19-22
    4.1 灭活全病毒疫苗  19-20
    4.2 亚单位疫苗  20
    4.3 重组活载体疫苗  20-21
    4.4 核酸疫苗  21
    4.5 通用疫苗  21
    4.6 反向遗传技术在禽流感疫苗研制中的应用  21-22
    4.7 新型疫苗  22
  5 本研究的目的和意义  22-23
第二章 两株H9 亚型禽流感病毒全基因组的序列分析  23-58
  1 试验材料  23-24
    1.1 材料  23
    1.2 主要试剂  23
    1.3 主要仪器及材料  23-24
    1.4 阿氏液配制  24
    1.5 1%鸡红细胞悬液制备  24
    1.6 LB 培养基配制  24
  2 试验方法  24-30
    2.1 病毒分离  24
    2.2 病毒的血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验  24
    2.3 引物设计与合成  24-25
    2.4 尿囊液病毒RNA 的抽提  25-26
    2.5 RT-PCR  26-27
      2.5.1 反转录（RT）（40μL 反应体系）  26
      2.5.2 PCR（50μL 反应体系）  26-27
    2.6 PCR 产物电泳鉴定  27
    2.7 PCR 产物切胶回收  27-28
    2.8 回收产物与pMD18-T vector 的连接  28
    2.9 DH5α感受态细胞的制备（采用氯化钙法）  28
    2.10 连接产物的转化  28-29
    2.11 重组质粒的提取  29
    2.12 重组质粒的PCR 鉴定（50μl 反应体系）  29
    2.13 目的基因的核苷酸序列测定、拼接及分析  29-30
  3 结果与分析  30-54
    3.1 病毒分离结果  30
    3.2 H9 亚型AIV 全基因组片段扩增结果  30
    3.3 重组质粒PCR 鉴定结果  30-31
    3.4 HA 基因序列测定与遗传进化分析  31-33
      3.4.1 HA 基因的核苷酸和氨基酸序列测定  31
      3.4.2 HA 基因的序列分析  31-32
      3.4.3 HA 基因序列同源性分析  32-33
      3.4.4 HA 基因序列遗传进化树分析  33
    3.5 NA 基因序列测定与遗传进树分析  33-35
      3.5.1 NA 基因的核苷酸和氨基酸序列测定  33-34
      3.5.2 NA 基因的序列分析  34
      3.5.3 NA 基因序列同源性分析  34-35
      3.5.4 NA 基因序列遗传进化树分析  35
    3.6 M 基因序列测定与遗传进树分析  35-36
      3.6.1 M 基因的核苷酸和氨基酸序列测定  35
      3.6.2 M 基因的序列分析  35-36
      3.6.3 M 基因序列同源性分析  36
      3.6.4 M 基因序列遗传进化树分析  36
    3.7 NS 基因序列测定与遗传进树分析  36-37
      3.7.1 NS 基因的核苷酸和氨基酸序列测定  36
      3.7.2 NS 基因序列同源性分析  36-37
      3.7.3 NS 基因序列遗传进化树分析  37
    3.8 NP 基因序列测定与遗传进树分析  37-38
      3.8.1 NP 基因的核苷酸和氨基酸序列测定  37
      3.8.2 NP 基因序列同源性分析  37
      3.8.3 NP 基因序列遗传进化树分析  37-38
    3.9 PB1 基因序列测定与遗传进树分析  38
      3.9.1 PB1 基因的核苷酸和氨基酸序列测定  38
      3.9.2 PB1 基因序列同源性分析  38
      3.9.3 PB1 基因序列遗传进化树分析  38
    3.10 PB2 基因序列测定与遗传进树分析  38-39
      3.10.1 PB2 基因的核苷酸和氨基酸序列测定  38
      3.10.2 PB2 基因序列同源性分析  38-39
      3.10.3 PB2 基因序列遗传进化树分析  39
    3.11 PA 基因序列测定与遗传进树分析  39-54
      3.11.1 PA 基因的核苷酸和氨基酸序列测定  39
      3.11.2 PA 基因序列同源性分析  39
      3.11.3 PA 基因序列遗传进化树分析  39-54
  4 讨论  54-57
    4.1 HA 基因氨基酸序列分析讨论  54-55
    4.2 NA 基因氨基酸序列分析讨论  55
    4.3 8 个基因的同源性和遗传演化分析讨论  55-57
  5 小结  57-58
结论  58-59
参考文献  59-65
附录  65-79
致谢  79

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
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