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正文：尿毒症为慢性肾功能不全的终末阶段,在我国每年新发病率为0.01%,其中大多数为青壮年,严重影响了人们的健康和生命安全。肾移植是治疗终末期肾病的最佳治疗手段,可以显著的提高终末期肾病患者的生活质量,减少并发症的发生,并降低终末期肾病的死亡率。虽然随着移植手术技巧的改进,新型免疫抑制药物的应用,围手术期并发症及早期急性排斥反应发生率明显减低,大大增加了移植肾一年的存活率,然而移植肾的半寿期并未明显提高,慢性移植肾病受到越来越多的关注。移植肾冷缺血所造成的冷缺血再灌注损伤是临床器官移植不可避免的病理生理过程,是慢性移植肾病的危险因素之一。供肾的冷缺血时间(coldischemia time CIT)是造成肾移植患者术后发生移植肾功能延迟恢复(delayed graft function DGF)的主要原因,而DGF和急性排斥反应(acute rejection episodes ARE)的发生是影响肾脏存活时间的重要因素近年来的研究发现,炎症、免疫反应参与了缺血再灌注损伤。缺血再灌注过程中炎症细胞聚集增加、细胞因子表达上调及T细胞介导的免疫反应等是造成肾组织损伤的重要因素。免疫系统是机体在长期进化中逐步形成的一套机制复杂的防御系统,包括天然免疫和获得性免疫。现已广泛认为,获得性免疫的激活需要先天性免疫系统的参与,尤其是先天性免疫系统中的TLRs家族,它们是先天性免疫的信号发动受体,TLRs除了识别病原相关的分子模式(PAMP),如细菌、病毒、真菌和原虫外,同样能识别多种因素引起损伤时受损细胞或坏死细胞释放的内源性配体,如高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1,HMGB1)等,进而引发一系列的炎症反应.HMGB1是一类早在30多年前就发现的非组蛋白(nonhistone chromatin protein,NHCP),属于高迁移率族蛋白(high mobility group protein,HMG)家族,早期的研究认为HMGB1是一种核内蛋白,通过与DNA的相互作用参与核内诸如转录、复制、重组等复杂有序的功能过程。近年来的研究发现,核外HMGB1可能具有“早期”和“晚期”炎症介质的作用,在关节炎、脓毒血症、创伤、急性肺损伤、缺血再灌注损伤等各类急慢性炎疾病的中,HMGB1被证实扮演了重要的角色。在目前国内及国外的研究中,针对HMGB1的研究集中在以大鼠热缺血再灌注为模型的动物实验。研究提示内源性配体(HMGB1)与TLRs结合能诱导树突状细胞(DC)的成熟,除了产生细胞因子和化学因子,成熟的DC表面共同刺激分子能提供“第二信号”给T淋巴细胞。TLRs与配体结合后在DC中通过T辅助细胞(TH细胞)激活来引发效应。反之,若缺乏TLRs的外源性和内源性配体,那么TLRs无法激活,则DC成熟障碍,而未成熟的DC不能启动T淋巴细胞反应。肾脏冷缺血再灌注损伤机制、损伤特点尚不明确。实验研究中,阻断胞外HMGB1的活性,已成为干预相关疾病过程的重要策略。丙酮酸乙酯(Ethyl pyruvate,EP)是美国食品和药品管理局划分为无毒性物质的一种食品添加剂,有显著的抑制HMGB1的合成与释放作用,对器官缺血再灌注损伤有保护作用,对其进行进一步研究具有重大的临床价值。本课题通过研究HMGB1在不同大鼠肾脏缺血再灌注模型中的表达,以及应用EP进行干预的结果,旨在讨论如下问题：1、构建大鼠肾脏热缺血再灌注损伤及冷缺血再灌注损伤,观察缺血后不同时间段HMGB1,炎症因子NF-κB、TNF-α的表达,以及肾脏损伤程度；2、探讨HMGB1启动肾脏热、冷血再灌注损伤后获得性免疫反应的机制；3、对于大鼠热缺血再灌注损伤进行EP干预性治疗,并观察疗效,并据此进行大鼠冷缺血再灌注损伤治疗,以提供防治肾脏冷缺血再灌注损伤的免疫学治疗方案。在目前器官供体紧缺情况下,如何维持器官冷缺血时间更长的保存期,以拓宽供体的使用范围,减少因供体冷缺血时间过长而导致移植后的移植物功能延迟恢复及移植器官病的发生率,延长移植肾半衰期,有重要的研究意义。第一章HMGB1在热缺血再灌注损伤中肾脏表达和干预研究目的：探讨HMGB1引发肾脏热缺血再灌注损伤的途径,明确HMGB1在热缺血再灌注损伤中肾脏表达,应用EP进行干预性治疗,明确EP进行治疗的效果。方法：60只健康清洁级Sprague-Dawley (SD)雄性大鼠被随机分为假手术组(n=20)、热缺血再灌注组(n=20)、丙酮酸乙酯(EP)治疗组(n=20)。采用夹闭左肾蒂使左侧肾脏缺血45 min再恢复血流并切除右侧肾脏制模。EP治疗组缺血前20min及再灌注前分别经阴茎背静脉注射EP 3.26 g/L(溶于林格液1 ml中),假手术组和热缺血再灌注组均经阴茎背静脉分别注射林格液1 ml,于术后6h、1d、3d、5d取下腔静脉血检测血肌酐、尿素氮水平,处死动物后取肾脏组织标本,应用RT-QPCR方法检测NF-κB、肿瘤坏死因子α(TNF-α),应用western blot方法检测HMGB1表达及免疫组化方法检测肾脏损伤程度。结果：热缺血再灌注组及EP治疗组HGMB1水平均高于正常对照组,其中热缺血再灌注组高于EP治疗组；热缺血再灌注组和EP治疗组血清CRE、BUN水平均显著高于正常对照组,其中热缺血再灌注组高于EP治疗组；热缺血再灌注组和EP治疗组NF-κB、TNF-α水平均显著高于正常对照组,其中热缺血再灌注组高于EP治疗组；热缺血再灌注组及EP治疗组肾脏损伤程度。结论：各组肾脏标本中均检测到HMGB1的表达,肾脏热缺血再灌注损伤后HMGB1表达升高,导致CRE、BUN、TNF-α、NF-κB表达增高,应用EP可减少HMGB1表达,CRE、BUN、TNF-α、NF-κB升高程度减低,有助于减轻热缺血再灌注所致肾损伤。第二章HMGB1在冷缺血再灌注损伤中肾脏表达和干预治疗目的：探讨HMGB1引发肾脏冷缺血再灌注损伤的机制,明确HMGB1在肾脏冷缺血再灌注损伤中的表达。根据热缺血再灌注损伤试验结果,应用EP进行干预性治疗,明确EP进行治疗的效果。方法：60只健康清洁级Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠被随机分为假手术组、冷缺血再灌注组、丙酮酸乙酯(EP)治疗组。构建右肾冷缺血再灌注损伤模型。EP治疗组缺血前20min及再灌注前分别经阴茎背静脉注射EP 3.26 g/L(溶于林格液1 ml中),假手术组和冷缺血再灌注组均经阴茎背静脉分别注射林格液1 ml,于术后6h、1d、3d、5d取下腔静脉血检测血肌酐、尿素氮水平,应用RT-QPCR方法检测NF-κB、肿瘤坏死因子α(TNF-α),处死动物后取肾脏组织标本,应用western blot及免疫组化方法检测肾组织HMGB1表达情况及肾脏损伤程度。结果：冷缺血再灌注组及EP治疗组HGMB1水平均高于正常对照组,其中冷缺血再灌注组高于EP治疗组；冷缺血再灌注组和EP治疗组血CRE、BUN水平均显著高于正常对照组,其中冷缺血再灌注组高于EP治疗组；冷缺血再灌注组和EP治疗组NF-κB、TNFα水平均显著高于正常对照组,其中冷缺血再灌注组高于EP治疗组。结论：各组肾脏标本中均检测到HMGB1的表达,肾脏冷缺血再灌注损伤HMGB1、CRE、BUN、TNF-α、NF-κB变化趋势与热缺血再灌注损伤相同,但升高程度较低。考虑损伤机制与热缺血再灌注损伤相同,应用EP阻断HMGB1有助于减轻冷缺血再灌注所致肾损伤。
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