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CSFV NS2基因导入PK-15细胞后对该病毒复制的影响

作　者: 王茁
导　师: 赵福广；涂长春
学　校: 吉林农业大学
专　业: 生物物理学
关键词: 猪瘟病毒非结构基因NS2 病毒复制
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 29次
引　用: 1次
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内容摘要

猪瘟(CSF)是具有高发病率和高死亡率的高度接触性传染病,以出血性高热及免疫抑制为发病特征。CSF的病原体是猪瘟病毒(CSFV),是一个具有囊膜的病毒,其直径在40nm到50nm之间。该病毒属于黄病毒科瘟病毒属病毒,其基因组为一条单股正链RNA。它编码一个大的多聚蛋白,该蛋白被进一步加工成为多个成熟的蛋白。病毒基因组大小约为12.3kb,包含了一个大的开放阅读框,理论上最终可翻译出12个成熟的蛋白质。分别为Npro, C, Erns, E1, E2, p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A和NS5B。猪瘟常常给世界范围内许多国家的养猪业造成严重的经济损失,所以世界动物卫生组织(OIE)将其定为必须通报的传染病之一。近些年来,猪瘟的流行形势及发病特征出现了新变化,发病症状不明显,不导致感染猪迅速死亡的温和型感染、慢性感染和非典型性感染大量出现,甚至免疫猪也有感染现象出现。人们必须对出现的新问题予以足够的重视并且尽快找到应对这些困难的新方法。从基因组水平上分析病毒感染对宿主细胞的影响意义重大且任务艰巨,还要克服许多技术上的障碍,最终目的是为开发出更多防治猪瘟的新药。寻求猪瘟防治新方法的关键在于对CSFV致病机制的深入研究。病毒进入宿主细胞后,在其复制和增殖的过程中,经过生物大分子不断地调整以适应胞内环境。目前,人们对CSFV和宿主细胞间的相互作用机制了解的较少。相比较其他非结构基因,现有报道对于NS2基因功能方面的研究甚少,但现有研究成果表明NS2基因在病毒复制过程中发挥着重要作用。所以,有必要对NS2基因进行深入的研究。为了更真实且系统的研究CSFV NS2基因在病毒复制中的作用,将NS2基因导入PK-15细胞中,然后对细胞进行接毒处理来观测其对病毒复制的影响。首先登陆Genbank,查询CSFV Shimen株全基因组序列,最终将登陆号为AF092448的序列确定为CSFV NS2基因引物设计的参照序列,再由病毒基因组经PCR反应扩增所需目的基因CSFV NS2。本实验中将限制性核酸内切酶、组氨酸标签、起始密码子及终止密码子插入引物序列中,将目的片段扩增后连接入逆转录病毒表达载体pLXRN。测序正确后,将重组病毒载体命名为pLXRN-NS2。重组的质粒被转染入猪肾细胞PK-15中,经G418的抗性压力筛选,获得PK-15细胞的稳定克隆。通过PCR的扩增分析可知,NS2基因已导入PK-15细胞基因组中。为了揭示基因导入后对CSFV复制的影响,本实验在对细胞接毒后,应用荧光定量PCR技术检测病毒复制的变化。荧光定量PCR是一种敏感性和特异性较好,且能快速检测CSFV的一种方法。本研究应用TaqMan荧光探针绝对定量的方法,成功检测出了细胞中病毒基因的拷贝数。本实验在接毒后24,48和72小时三个时间点从细胞中提取总RNA，然后用荧光定量PCR检测病毒基因的拷贝数。通过对检测结果进行比较可知,导入NS2基因的细胞中病毒基因拷贝数远小于普通细胞且结果差异十分显著。在接毒后24、48和72小时,未经转染的细胞中病毒基因拷贝数是导入NS2基因细胞中病毒基因拷贝数的13.6倍、163.6倍和104.4倍。由此得出,NS2基因导入细胞后一定程度上抑制了CSFV的复制。这一研究结果为今后研究NS2基因与CSFV复制过程的相互作用奠定了基础,推进了对CSFV致病机制的研究,为防治猪瘟新药剂的开发提供了新思路。综上所述,NS2在CSFV复制过程中具有重要作用。目前研究表明该病毒病的发生和发展是多基因参与,多步骤、多阶段组成的过程,CSFV NS2基因在此过程中的作用还有待于更深入的研究。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-11
第一章前言  11-22
  1.1 研究的目的及意义  12-13
  1.2 国内外研究现状  13-19
  1.3 研究的内容和方法  19-22
第二章插入CSFV NS2基因的重组逆转录病毒载体的构建  22-31
  2.1 材料  22-23
  2.2 方法  23-27
  2.3 结果  27-30
  2.4 讨论  30
  2.5 小结  30-31
第三章转染NS2基因的PK-15细胞的筛选与鉴定  31-37
  3.1 材料  31-32
  3.2 方法  32-34
  3.3 结果  34-35
  3.4 讨论  35-36
  3.5 小结  36-37
第四章荧光定量PCR检测NS2基因对CSFV复制的影响  37-43
  4.1 材料  37
  4.2 方法  37-39
  4.3 结果  39-41
  4.4 讨论  41-42
  4.5 小结  42-43
结论  43-44
参考文献  44-48
附录  48-49
致谢  49-50
作者简介  50

CSFV NS2基因导入PK-15细胞后对该病毒复制的影响

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